基于网络药理学探讨丹参酮ⅡA治疗缺血性中风的机制研究

钟达源，李兰，马若梦，蒋成婷，邓奕辉

(湖南中医药大学，湖南 长沙 410208)

根据世界卫生组织的报告，中风是全球第二大死亡原因[1]。仅在2016年，就有约550万人死于中风[2]。根据中国最新的人口普查结果，中国的中风发生率约为1.6%，其中缺血性中风(IS)占21.4%[3]。循证医学研究表明，大部分缺血性中风是由于血凝块阻塞脑血管而引起的[4]，血浆纤维蛋白原升高是脑血管疾病的重要致病因素[5], 其含量升高会引起血浆黏度上升,增加红细胞和血小板聚集性,提高全血黏度,促使血栓形成，从而导致缺血性事件的发生。研究表明，在缺血性脑血管病患者及其高危人群中，凝血酶活性普遍增强[6]。动物实验发现，在大脑中动脉闭塞大鼠模型的缺血中心区域，凝血酶的活性显著增加，凝血酶原基因表达上调[7]。体外实验显示，凝血酶的非蛋白水解活性可以激活小胶质细胞[8]，增强小胶质细胞吞噬作用，从而对神经元造成损伤[9]。中医学并无缺血性中风这一病名，根据其症状表现，将其归属于 “中风”，其发病多责之于“虚、风、火、痰、瘀”[10]。后世医家更强调“瘀”的作用[11]。丹参是双子叶唇形科植物丹参的干燥根和根茎,具有活血化瘀的功效。丹参酮ⅡA是从丹参的根中分离出的二萜醌,对IS的治疗具有确切疗效。董玉宝[12]的研究发现，丹参酮ⅡA联合尼莫托普治疗创伤性脑梗死的临床疗效明显提高。有Meta分析结果表明，丹参酮ⅡA治疗可改善IS急性期的神经功能缺损评分和患者的日常生活活动[13]。何晓静等[14]发现丹参酮ⅡA可以延长断头后小鼠的生存时间，增加断头后的喘息次数，改善中风小鼠的神经行为,增加小鼠脑缺血再灌注损伤后脑组织中SOD酶的活性，并降低MDA含量。这种保护作用可能是由于丹参酮ⅡA降低了受损组织的ROS因子含量，从而减少了受损组织的氧化应激损伤，并最终减轻了脑缺血后的炎症损伤[15]。这表明丹参酮ⅡA具有抗炎、抗氧化和抗凋亡作用，对IS具有神经保护作用。目前，针对丹参酮ⅡA治疗IS的研究逐渐深入，但尚无针对其起效的具体分子作用机制的研究。因此本文基于网络药理学研究方法，对丹参酮ⅡA治疗IS的分子靶点及通路进行预测，并通过分子对接进行了验证。

1 材料和方法

1.1 材料

PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/#query=Loxanol%20V)[16]，PharmMapper数据库(http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/index.html)[17]，UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)[18]，GeneCards数据库(https://www.genecards.org/Search/Keyword?queryString=coronavirus)[19]，Protein-Ligand Interaction Profiler数据库(https://plip.biotec.tu-dresden.de/plip-web/plip/index)[20],Cytoscape3.6.1软件[21]，OpenBabel-2.4.1软件[22]，Ledock软件[23]，Pymol软件[24]。

1.2 丹参酮ⅡA靶点的收集与处理

通过PubChem数据库查找丹参酮ⅡA的3D结构，并导入到PharmMapper数据库中以预测其分子靶点。将预测得到的丹参酮ⅡA靶点名由UniProt数据库中的UniProtKB搜索功能进行注释，并且通过String数据库构建了蛋白质相互作用网络(PPI)。通过GeneCards数据库搜索3 350个IS疾病目标，并将PPI网络中包含的丹参酮ⅡA靶点与IS疾病靶点进行相交取共同子集，从而获得丹参酮ⅡA治疗IS的靶点。

1.3 丹参酮ⅡA治疗IS关键靶点的GO和KEGG富集分析

将丹参酮ⅡA治疗IS的关键靶点通过R软件的clusterProfiler[25]程序包进行了GO和KEGG富集分析，筛选有关通路，剔除无关通路；根据靶点在通路上的富集定位，整合所有通路，构建丹参治疗糖尿病神经病变靶点通路图。

1.4 丹参酮ⅡA与16个关键疾病靶点的分子对接

从PDB数据库下载了关键蛋白质的pdb结构文件，并通过Ledock软件对其进行脱配体加氢处理。然后通过PubChem数据库下载丹参酮ⅡA的sdf格式文件，并通过OpenBabel-2.4.1转换为mol文件。用Ledock软件计算丹参酮ⅡA与16个关键靶点的分子对接能，并通过Pymol软件和Protein-Ligand Interaction Profiler数据库进行可视化。

2 结果

2.1 网络药理研究流程图

从PubChem数据库获取化合物的3D结构，将其导入PharmMapper数据库以预测化合物的靶点。然后从UniProt数据库中获得基因注释信息，并将靶点信息导入String数据库中以构建靶点PPI网络。从GeneCards数据库下载IS靶点数据，在与药物靶点相交后获得药物治疗IS的靶点。用Cytoscape软件构建网络后，可以通过网络分析功能进行网络拓扑分析以筛选关键靶点。通过R软件的clusterProfiler软件包分析丹参酮ⅡA治疗IS的关键靶点，并进行GO和KEGG富集分析。再通过Ledock软件进行丹参酮ⅡA与关键靶点的分子对接，最后通过Pymol软件和Protein-Ligand Interaction Profiler数据库进行可视化分析，流程见图1。

图1 网络药理研究流程图

2.2 丹参酮ⅡA靶点预测及靶点PPI网络的构建

通过PubChem数据库搜索丹参酮ⅡA的3D结构，并将其导入PharmMapper数据库以预测其分子对接目标。以Normfit>0.6作为筛选条件，筛选出82个丹参酮ⅡA靶点，并将其导入到String数据库中构建PPI。以combined score>0.7作为优化PPI网络的条件，获得了70种靶蛋白之间的相关网络，如图2所示。

图2 丹参酮ⅡA靶点的PPI网络

2.3 丹参酮ⅡA-靶点-IS网络构建

将PPI网络中包含的70个靶点与3 350个IS疾病靶点相交取共同子集,得到丹参酮ⅡA治疗IS靶点55个。基于以上结果，构建“丹参酮ⅡA-靶点-IS”关系网络，如图3所示。该网络包含72个节点和303个边，平均度数为4.21。以Degree>10作为筛选条件，获得了丹参酮ⅡA治疗IS的16个关键靶点，包括MAPK1、MAPK8、EGFR、SRC、HSP90AA1、ESR1、ALB、MAPK14、CASP3、AR、RXRA、PGR、CTNNA1、CDK2、NOS3和KDR，如表1所示。

2.4 GO富集分析

用R软件的clusterProfiler[25]程序包对丹参酮ⅡA治疗IS的16个关键目标进行GO富集分析，获得了87个相关的GO条目。通过P<0.001的筛选，得到26条主要参与丹参酮ⅡA治疗IS的GO项目。主要包括核受体活性、配体激活的转录因子活性、类固醇激素受体活性、MAP激酶活性、支架蛋白结合、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性、ATPase结合、β-catenin结合、类固醇结合、MAP激酶激酶活性和其他生物学功能。见表2。

图3 丹参酮ⅡA-靶点-IS关系网络图

表1 丹参酮ⅡA治疗IS的关键靶点

2.5 KEGG富集分析

通过R软件的clusterProfiler[25]程序包进行KEGG富集分析，结果显示丹参酮ⅡA治疗IS主要涉及 9条KEGG信号通路。主要包括内分泌抗性、FoxO信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂抵抗、MAPK信号通路、ErbB信号通路、Rap1信号通路、Ras信号通路、HIF-1信号通路和铂类药物抗性。见表3。

表2 丹参酮ⅡA在IS治疗中GO富集分析结果

表3 丹参酮ⅡA治疗IS的KEGG富集分析结果

2.6 丹参酮ⅡA与靶蛋白的分子对接得分及结构

丹参酮ⅡA与16种靶蛋白分子对接。从PubChem数据库下载了tanshinoneⅡA的sdf格式文件，然后通过OpenBabel-2.4.1转换为mol文件。从Pdb数据库下载目标蛋白的pdb结构文件，并通过Ledock软件进行去除配体和加氢处理后进行分子对接。结果显示，丹参酮ⅡA与PGR、CDK2、MAPK1、KDR和EGFR的分子对接分数均小于-5 kcal/mol，这表明丹参酮ⅡA与这些靶点的对接结构相对稳定，如表4。通过Pymol软件可视化对接结构，该结构如图4～8所示。

丹参酮ⅡA与PGR的亲和能为-5.29 kcal/mol，低于-5 kcal/mol，表明丹参酮ⅡA对PGR具有很强的亲和力。丹参酮ⅡA占据了由PGR蛋白中LEU-797、LEU-763、PHE-778、LEU-718和LEU-887残基形成的活性腔。丹参酮ⅡA分子与LEU-797、LEU-763、LEU-718和LEU-887的残基形成疏水键。此外，丹参酮ⅡA和PHE-778残基形成π堆积，如图4所示。

表4 丹参酮ⅡA与16种靶蛋白的分子对接分数表

图4 丹参酮ⅡA和PGR的分子对接结构图

丹参酮ⅡA和CDK2亲和能为-5.16 kcal/mol，低于-5 kcal/mol，表明丹参酮ⅡA对CDK2具有很强的亲和力。丹参酮ⅡA占据了CDK2蛋白中LYS-89、ILE-10、VAL-18、VAL-64、PHE-80和LEU-887残基组成的活性腔。丹参酮ⅡA分子与LYS-89形成氢键。丹参酮ⅡA与残基,如ILE-10、VAL-18、VAL-64、PHE-80和LEU-887形成多个疏水键。如图5所示。

丹参酮ⅡA与MAPK1亲和能为-5.04 kcal/mol，低于-5 kcal/mol，表明丹参酮ⅡA与MAPK1有很强的亲和力。丹参酮ⅡA占据了MAPK1蛋白中由MET-108、LEU-156和ILE-31残基组成的活性腔。丹参酮ⅡA分子与MET-108形成氢键。丹参酮ⅡA与残基(如LEU-156和ILE-31)形成疏水键。如图6所示。

丹参酮ⅡA与KDR的亲和能为-5.02 kcal/mol，低于-5 kcal/mol，表明丹参酮ⅡA对KDR具有很强的亲和力。丹参酮ⅡA占据了KDR蛋白中的残基(如PHE-916、PHE-105、CYS-917、VAL-914、ALA-864、LEU-1033和LEU-838)形成的活性腔。丹参酮ⅡA分子与CYS-917形成氢键。丹参酮ⅡA与残基,如PHE-916、PHE-105、VAL-914、ALA-864、LEU-1033和LEU-838形成疏水键。如图7所示。

图5 丹参酮ⅡA和CDK2的分子对接结构图

图6 丹参酮ⅡA和MAPK1的分子对接结构图

图7 丹参酮ⅡA和KDR的分子对接结构图

丹参酮ⅡA与EGFR的亲和能为-5 kcal/mol，表明丹参酮ⅡA对EGFR具有很强的亲和力。丹参酮ⅡA占据了EGFR蛋白中LEU-844、MET-793和LEU-718残基形成的活性腔。丹参酮ⅡA分子与MET-793形成氢键。丹参酮ⅡA与残基(如LEU-844和LEU-718)形成疏水键。如图8所示。

图8 丹参酮ⅡA和EGFR的分子对接结构图

3 讨论

缺血性中风(IS)是造成死亡、后天性残疾的常见原因[26]。其发病机理主要是由于动脉硬化导致的血液流动变缓，血液成分改变和血液黏度增加。因此治疗的关键是尽快改善缺血区域的血液循环，消除继发性水肿，恢复脑细胞的正常代谢和神经功能。目前针对该病的治疗主要是通过动静脉溶栓、非支架式机械取栓术和支架式机械取栓术的治疗[27]。其中静脉药物溶栓治疗时间较严格(急性脑血管闭塞3～4.5 h)，大动脉闭塞再通率低，治疗效果较差。而继发于急性脑血管闭塞的脑梗死主要是由脑动脉狭窄的大量血栓形成所致。即使溶栓后血管再次畅通，但仍会发生再次阻塞的问题[28]。不仅如此，长期应用溶栓药容易诱发颅内出血。其中静脉内溶栓导致颅内出血的发生率约为6.4%，而动脉溶栓的发生率则接近10%。这使得病情转向恶化，因此治疗效果不是特别理想[29-30]。为此有必要寻找更为有效的药物对其进行治疗，中药丹参及其提取物已广泛用于心脑血管疾病的治疗[31]。动物实验研究发现，丹参中所含的丹参酮可以有效抵抗中枢神经系统的缺血性损伤，并保护缺血区域的神经元，减少由缺血再灌注引起的延迟性神经元凋亡，减少水肿，缩小脑梗塞范围，并改善脑缺血引起的神经系统症状。有研究发现[32],作为丹参的主要活性成分之一的丹参酮ⅡA对大鼠短暂性局灶性脑缺血具有显著的保护作用，对永久性局灶性脑缺血同样具有良好的保护作用[33]。尽管已有大量研究证实丹参酮ⅡA对IS的治疗作用，但IS是一个复杂的疾病，其病变涉及多个脏腑、多种病机途径及多条信号通路。目前虽然已经有大量研究肯定了丹参酮ⅡA对IS的治疗作用，但丹参酮ⅡA中包含靶点众多，要想明确丹参酮ⅡA治疗IS的机制就显得困难重重，网络药理学是通过分析大数据来进行药物研究的新模式[34-35]，通过网络药理学方法，可以预测丹参酮ⅡA治疗IS的靶点以及机制，从而指导丹参酮ⅡA治疗IS的研究方向。

网络拓扑分析结果表明，蛋白PGR、CDK2、MAPK1、KDR、EGFR、ALB、ESR1、CASP3、HSP90AA1、MAPK8、NOS3、RXRA、AR、CTNNA1、MAPK14及SRC关联度较高，表明这些蛋白是丹参酮ⅡA治疗IS的关键靶点。GO富集分析结果发现中药丹参酮ⅡA治疗IS涉及多个生物功能，主要参与核受体活性、配体激活的转录因子活性、类固醇激素受体活性、MAP激酶活性、支架蛋白结合、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性、ATPase结合、β-catenin结合、类固醇结合和MAP激酶激酶活性。核受体是一种重要的转录因子，在各种生命活动中起调节作用。大多数核受体是配体依赖性转录因子，可以被外源性物质和内源性化合物识别并激活。不仅如此与配体结合的核受体可还以调节靶基因的表达和活性从而影响药物的药代动力学和药效过程[36]。有研究表明[37-38],核受体在中药的代谢和中药的相互作用中起着重要的调节作用。丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)在应激反应(例如炎症和细胞凋亡)中起重要作用。凋亡是导致神经元死亡的主要方法之一[39]，这对于人体清除受损细胞并维持生命具有重要意义。在缺血性脑损伤期间，神经元坏死和细胞凋亡同时发生。坏死主要发生在中央缺血区域，而凋亡主要发生在半明半暗带区域。半明半暗带是梗塞周围的脑组织，它的一部分功能受损，但可修复。丹参酮ⅡA可以保护该区域的神经元并减少脑梗塞区域。选择性神经元死亡通常发生于缺血性损伤后3～4 d。这种现象称为延迟神经元死亡(DND)。DND与细胞凋亡的发生密切相关[40]。已经发现许多参与细胞凋亡信号调节的蛋白质，其中Bcl-2基因家族在细胞凋亡的线粒体途径中起着重要的调节作用。该家族包括促进凋亡的蛋白质和抑制凋亡的蛋白质。Caspase-3被认为是细胞凋亡最关键的凋亡蛋白酶。Caspase-3的激活最终将导致细胞凋亡。如果可以通过抑制细胞凋亡基因的表达或减少细胞凋亡相关蛋白的表达来抑制细胞凋亡过程，则有可能减少脑缺血期间神经元死亡的数量。而丹参酮ⅡA可以显著减少梗塞区域周围神经元的凋亡数量、抑制Caspase-3的活性并增加Bcl-2的表达[41]，这表明丹参酮ⅡA可以通过抑制细胞凋亡来保护神经元免于缺血和缺氧。

KEGG富集分析结果表明，丹参酮ⅡA治疗IS主要涉及内分泌抵抗、FoxO信号传导、EGFR酪氨酸激酶抑制剂抵抗、MAPK信号传导、ErbB信号传导、Rap1信号传导、Ras信号传导、HIF-1信号通路和铂类药物耐药性。最新研究还发现Ras信号通路[42]、FoxO信号通路[43]和MAPK信号通路[44]与IS的发病机理密切相关。许多研究表明，有丝分裂原激活的蛋白激酶信号通路(MAPKs)参与细胞内炎症和细胞存活的调节[45]，而由细胞外信号调节激酶(ERK)介导的信号通路调节Bax/Bcl-2/Bcl-xL的表达在脑缺血再灌注损伤引起的细胞凋亡过程中起重要作用[46]。进一步的研究表明，聚乙二醇纳米丹参酮ⅡA与阳离子化牛血清白蛋白联合使用可以显著降低ERK1/2基因的表达水平和相应的蛋白表达[47]，这表明丹参酮ⅡA的抗凋亡作用是与MAPK信号通路的调节有关，而这也从反面验证了本研究结果的准确性。表明本研究结果可为丹参酮ⅡA治疗IS的后续研究提供重要依据，而这也将对未来论证中医药基础理论的科学性提供有价值的参考。但因网络药理学研究方法的局限性，此研究的部分结果可能欠缺严谨，仍需进一步的细胞实验、动物实验以及临床研究进行验证。