四种不同传染性喉气管炎疫苗免疫应激性及保护性评估

张义冉 李丽华 黄秀英 刘长清

摘  要：为了筛选出安全、高效的传染性喉气管炎疫苗，指导场区生产，我公司开展A、B、C、D四种传染性喉气管炎活疫苗的疫苗效力检测、免疫后眼部应激副反应及攻毒试验等研究。结果显示，A、B、D疫苗鸡胚接种效力检测结果符合标准;C疫苗不适合鸡胚效力试验。眼部应激反应，C苗应激反应最小，B、D疫苗次之，A疫苗最严重。攻毒试验表明，B疫苗免疫0.5羽份不能完全保护鸡群，保护率为90%，其余疫苗均可100%保护鸡群。综合结果表明，C、D两种传染性喉气管炎疫苗免疫0.5羽份效果较好，推荐在该病的流行区域内使用C、D公司的喉气管炎疫苗0.5羽份用于发病群和周边易感鸡群的紧急免疫接种。

关键词：鸡传染性喉炎;喉炎疫苗;免疫效果

中图分类号：S858.312.5    文献标识码：B    文章编号：1673-1085（2021）2-0014-06

鸡传染性喉气管炎（ILT）是由传染性喉气管炎病毒（ILTV）引起的一种急性、接触性呼吸道传染病，临床表现为伸颈张口呼吸、咳嗽和咳出血样的渗出物[1]，剖检症状为喉头、气管粘膜肿胀、出血和糜烂。本病传播快，死亡率较高，可引起鸡群死亡增加和产蛋下降，严重危害养鸡业的发展[2]。

病鸡、康复带毒鸡以及病毒污染物是本病的主要传染源，病毒主要通过呼吸道和眼结膜进行传播。为了有效控制本病的发生，本病流行地区通常选择鸡传染性喉气管炎弱毒疫苗进行免疫接种。本病毒只有一个血清型，但不同毒株的致病性和抗原性稍有差异，一些疫苗可造成鸡群很大的免疫应激，严重影响鸡群精神、采食、饮水、体重等各项指标。目前市售的疫苗有多種，但毒力和免疫效果有一定的差异，本试验通过疫苗效力测定，对鸡群分别免疫不同的传染性喉气管炎疫苗，观察免疫后各组鸡群的应激性、免疫效果（攻毒保护情况）来进行综合评估，为临床生产筛选安全、高效的传染性喉气管炎疫苗。

1  材料与方法

1.1  试验鸡群  80只40日龄健康京粉2号鸡，随机分为8个试验组，每组各10只，每只鸡佩戴翅号;20只SPF鸡作为阴性及阳性对照，每组各10只，分别饲养于不同的隔离器中。

1.2  疫苗来源  A、B、C、D四种传染性喉气管炎活疫苗，分别来自不同生产厂家。

1.3  攻毒用毒株  毒株为2019年山东流行毒株，病毒效价为105.0 EID50/0.1 mL。

1.4  试验分组及处理

1.4.1  疫苗效力检测  将各组疫苗用灭菌生理盐水稀释成每1.0 mL含5羽份，再继续作10倍倍比稀释，取10-2、10-3、10-4  3个稀释度，经绒毛尿囊膜途径分别接种11日龄SPF鸡胚，每个稀释度接种5枚，每胚0.1 mL。每日照蛋一次，将死胚取出标记死亡时间，放入4 ℃冰箱冷藏，待试验结束一并进行判定，接种后24 h内死亡的鸡胚弃去不计。鸡胚绒毛尿囊膜呈明显增厚、有灰白色病斑时，判为感染，计算EID50，每羽份病毒含量应不低于102.7 EID50。

1.4.2  鸡群分组及免疫  试验总共分为10组，其中A、B、C、D  4个疫苗试验组，每个疫苗组分2个小组，免疫羽份分别为0.5羽份和1羽份，免疫剂量均为0.1 mL，免疫方法为点眼;2个对照组均不免疫：阳性对照组后期进行攻毒，阴性对照组不做任何处理。

1.4.3  攻毒保护试验  在鸡群免疫后27 d（67日龄）进行攻毒保护试验。攻毒方法：将毒株进行10倍稀释，试验组和阳性对照组每只鸡进行喉头滴注法攻毒0.2 mL; 而阴性对照组5只鸡，注射毒株稀释液0.2 mL/只，剩余5只不做任何处理。

1.5  检测指标

1.5.1  免疫后眼部应激副反应  免疫后10 d，每天观察鸡只的精神状态、饮水、采食变化、呼吸道症状以及鸡的眼睛变化等。根据鸡群免疫后的临床症状将病变分为六级，制定相应打分标准：- +：眼部轻微炎症（0.5分）;+：眼窝周围肿 （1 分）;++：流泪，眼窝周围红肿（2分）;+++：眼窝红肿严重，肿头（3分）;++++：眼睑粘连（4分）; +++++：呼吸道症状（5分）;对免疫后鸡群的应激副反应进行记录并打分。

1.5.2  攻毒保护试验  喉炎疫苗免疫后27 d，各组每只鸡气管内注射鸡传染性喉气管炎强毒株0.2 mL（病毒效价为105.0 EID50/0.1 mL），持续观察10 d。每天观察各组鸡群眼部变化，记录死亡剖检情况，在试验结束后将全部病料进行PCR检测。

2  试验结果

2.1  疫苗检测  疫苗毒力检测结果见表1。

由表1可见，全程只有B疫苗以10-2稀释倍数在接种后96 h鸡胚死亡一枚;A、B、D疫苗鸡胚接种效力检测结果分别为103.7 EID50、103.5 EID50和103.3 EID50，均高于国标102.7 EID50，符合标准;C疫苗鸡胚效力为101.9 EID50，低于国标，效力检测不合格。

2.2  免疫应激反应

2.2.1  应激反应过程  各试验组鸡只免后眼部均出现较明显的应激反应，平均在免后第4天眼部开始有轻微反应，到免后第5天眼睑粘连最为严重，严重状态维持4 d，免后第9天鸡只开始逐渐好转，到免后14 d基本恢复正常。每组试验鸡具体应激反应情况见表2，应激反应过程见图1。

2.2.2  应激反应汇总对比  将免疫后每组鸡群具体的应激反应按照评分标准评分，每组具体评分结果见表3。应激反应合计评分的结果从轻微到严重排序为C

2.3  攻毒保护试验

2.3.1  鸡群精神状态变化  试验结果显示，在免疫组攻毒后第2天，鸡只开始出现炸毛、精神沉郁等现象;攻毒后第4天，鸡只炸毛现象减轻，B-0.5羽份组鸡只死亡1只;攻毒后第5天，鸡只状态开始好转;攻毒后第7天，A组疫苗鸡只炸毛现象比较严重。

阳性对照组鸡只在攻毒后24 h内无明显异常;攻毒后第2天，有的鸡只出现精神沉郁、打蔫、炸毛、甩头等临床症状;攻毒后第3天，隔离器内出现血迹;攻毒后第4天鸡只开始有死亡，攻毒后共死亡4只。

2.3.2  剖检和实验室诊断结果

2.3.2.1  死亡鸡只剖检及PCR检测结果  阳性对照组鸡只在攻毒后第4、5、6、8天各死亡1只（共4只），B-0.5羽份组在攻毒后第4天死亡1只;阳性对照组鸡只死亡前出现典型临床症状，如眼睛流泪、眼睑肿胀、粘连、伸颈呼吸、咳血等现象。剖检表现为喉头、气管附着粘液和黄色干酪物且容易剥离等变化。鸡只临床症状、实验室诊断结果与传染性喉气管炎病理变化和症状相符。具体结果见表4和图2。

2.3.2.2  未死亡鸡只剖检及PCR检测结果  阳性对照组：除个别鸡只外，其它鸡只剖检均有明显的病理变化，如喉头气管附着粘液和干酪物、肺病变、脾肿大等，且PCR结果均为阳性。免疫组：鸡只无喉炎典型的病理变化，实验室诊断结果显示PCR结果均为阴性。

2.4  综合试验结果  各组试验结果汇总情况见表5。

结果显示：疫苗效价评估部分，A、B、D疫苗鸡胚接种效力检测结果符合标准;C疫苗检测结果不符合标准;免后应激部分，攻毒后眼部应激反应由轻到重的排序为C-0.5羽份

3  讨论

鸡传染性喉气管炎对我国养禽业危害较大，该病自从1965年在国内首次报道以来，已在全国范围内蔓延，发病例数逐年增加。由于该病的病原鸡传染性喉气管炎病毒属于疱疹病毒，能够在鸡体内长期潜伏，受到某些刺激后能够大量复制并排毒从而引发疾病，增大了该病防控的难度[3-4]。康复带毒鸡和疫苗接种鸡可长期带毒，并向外界不断排毒，是主要的传染源[5]，因此，在疫区内及受威胁地区的鸡群必须将ILT免疫列入免疫程序，对5周龄以上的鸡进行免疫，并做好鸡场的隔离和安全防护，非疫区及5周龄以下鸡群免疫应谨慎[6]。

本次试验的毒株选用的是2019年山东分离的高致病性传染性喉气管炎毒株，病毒效价为105.0 EID50/0.1 mL，阳性对照组鸡群在攻毒后10 d内共死亡4只，且剖检病料PCR检测结果均为阳性，表明该毒株可100%导致鸡群发病。

疫苗效力检测结果显示，A、B、D疫苗鸡胚接种效力检测结果均高于国标102.7 EID50，符合标准;C疫苗鸡胚效力检测不合格，但C为细胞苗，不适合鸡胚效力检测。

目前对 ILTV 最有效的预防方法还是疫苗接种，其中点眼是最好的免疫方法[7]。现有传染性喉气管炎疫苗一般是减毒疫苗，但也会表现出减毒不完全，往往接种疫苗后表现一定的病理损伤（如产生不同程度的眼结膜炎，一般1～2周后恢复）[8]。刘兴彩[9]研究表明在使用传染性喉气管炎疫苗1羽份以下的免疫剂量进行免疫时，鸡群的免疫副反应相对较小，而且鸡群在 5 d内即可恢复;但本研究数据表明，整体来看，A、B、C、D疫苗0.5羽份和1羽份组鸡群平均在免后第4天开始有轻微反应，到免后第5天眼睑粘连最为严重，严重症状维持4 d左右，免后第9天鸡只开始逐渐好转，到免后14 d鸡只基本恢复正常。各试验组应激反应由轻到重排序为C-0.5羽份

本研究攻毒保护试验结果显示，攻毒10 d后，阳性对照组鸡群死亡4只，且病料PCR检测结果均为阳性，B-0.5羽份疫苗免疫组于攻毒后第4天死亡1只，且病料PCR检测结果为阳性，其余组别无死亡，表明B疫苗免疫0.5羽份不能完全保护鸡群，保护率为90%;其余疫苗均可100%保护鸡群。刘兴彩[9]喉炎免疫攻毒试验研究结果表明，0.2 羽份以上的免疫剂量可对鸡群产生较好的保护力，但随着免疫剂量的增大，免疫反应逐渐加重，因此结合本试验结果建议每只鸡进行传染性喉气管炎疫苗免疫时可应用 0.5 羽份的剂量。

从喉炎疫苗的效力检测、疫苗免疫后的应激反应到攻毒后的免疫保护试验结果显示，C、D两种传染性喉气管炎疫苗免疫0.5羽份效果较好，推荐在该病的流行区域内使用C、D公司的喉气管炎疫苗0.5羽份，以用于发病群和周边易感鸡群的紧急免疫接种。

参考文献：

[1]  吕荣修.禽病诊断彩色图谱[M].北京：中国农业大学出版社，2004：128.

[2]  Irit Davidson，Sagit Nagar，Israel Ribshtein. Detection of Wildand Vaccine -Type Avian Infectious Laryngotracheitis Virus in Clinical Samples and Feather Shafts of Commercial Chickens[J].American Association of Avian Pathologists.2009， 53（4）：618- 623.

[3]  陈永军.鸡传染性喉气管炎的流行病学、症状、诊断和防控[J].当代畜牧科技， 2018（4）：115.

[4]  冷秋仙，王群义，刘红祥，等.鸡传染性喉气管炎流行新特点及防控措施[J].家禽科学，2016（2）：44-45.

[5]  张国中，王晓婷，赵继勋，等.鸡传染性喉气管炎的流行病学特点及防控[J].兽医导刊，2010（2）：21-28.

[6]  张洪辉，曹守林，李宁，等.鸡传染性喉气管炎的研究进展[J].中国家禽，2012，2（02）：57-61.

[7]  郑德富，李平.鸡传喉疫苗的正确使用[J].畜禽业，2003（4）：63.

[8]  吳孔兴，陈峰，张秀丽，等.两种不同传染性喉气管炎疫苗应用的比较试验[J].中国禽业导刊，2005，22（2）：33.

[9]  刘兴彩，邹立宏，张力青，等.鸡传染性喉气管炎冻干苗（喉必妥）免疫保护试验[J].兽医导刊，2011（12）：72-74.

[10]  辜新贵，赖柏松，吴小春，等.五种鸡传染性喉气管炎疫苗免疫副反应的综合评估[J].中国家禽，2012，34（10）：48-50.

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