大骨节病与骨性关节炎膝关节软骨下骨差异表达miRNA及其调控网络分析

赵光辉，杨 磊，马建兵，惠曙国

(1. 西安市红会医院膝关节科，陕西西安 710054；2. 西安交通大学医学部护理学系，陕西西安 710061)

软骨下骨是在骨骼发育成熟后形成的位于关节软骨下的骨板，是关节的重要组成部分，包括皮质终板、下方的骨小梁结构及其间隙腔和血管[1]。目前，越来越多的研究已经证实软骨下骨在骨性关节炎(osteoarthritis, OA)发生和发展中具有重要的作用[2]，且有研究认为在骨性关节炎中软骨下骨重塑可先于软骨的退变[3]。大骨节病(Kashin-Beck disease, KBD)的典型病理改变为关节软骨、骺软骨和骺板软骨的变性与坏死[4]，目前其病因与发病机制研究主要集中在关节软骨层面。莫东旭等[5]研究发现，大骨节病患者软骨下骨及小梁骨存在明显的骨结构改变，骨性关节面有毛糙和不整的X线征象。MicroRNA(miRNAs)在骨性关节炎的发病过程和病理机制中扮演重要的角色，如其参与软骨细胞的增殖、凋亡、细胞外基质的代谢和软骨细胞炎症等过程，而且，其可以作为骨性关节炎早期诊断的重要生物标志物以及治疗的潜在分子靶点[6]。本研究通过比较大骨节病与骨性关节炎患者膝关节软骨下骨miRNA的表达差异，分析显著性差异的miRNA及其与靶基因的调控关系，以期进一步明确大骨节病患者软骨下骨的损伤特征及其与骨性关节炎的异同。

1 材料与方法

1.1 样本收集4例大骨节病及4例骨性关节炎软骨下骨标本均来自西安市红会医院接受膝关节置换手术的患者。大骨节病诊断依据WS/T 207-2010诊断标准进行，骨性关节炎诊断依据美国风湿病学会分类诊断标准进行。根据K-L放射学分级标准，所有大骨节病和骨性关节炎患者膝关节均为4级。本研究通过西安交通大学伦理委员会批准，所有标本取材前均取得患者及家属知情同意。

1.2 样本总RNA提取样本总RNA提取采用RNeasymini Kit试剂盒进行。首先，在液氮中研磨冷冻软骨下骨组织后进行匀浆处理；其次，按照试剂盒操作说明依次进行裂解和提取；最后，采用紫外分光光度计检测总RNA溶液的吸光度及其 RNA 的浓度，采用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 的纯度和完整性。

1.3 miRNA芯片分析miRNA表达谱分析采用Affymetrix公司miRNA 4.0芯片进行。首先，采用Genisphere Flash Tag标记试剂盒对样本总RNA进行生物素标记；其次，将标记的样品进行miRNA微阵列杂交；然后，按照标准操作步骤对杂交阵列进行扫描和分析。

1.4 芯片数据分析采用AGCC(Affymetrix Gene Chip Command Console) 软件对芯片结果进行背景校正和片间归一化预处理，并根据样品表达模式进行相关性聚类分析；采用SAM(Significance Analysis of Microarray)R程序包分析差异表达miRNA，筛选标准为q-value ≤5%且Fold Change ≥2或≤0.5。

1.5 miRNA靶基因预测及调控网络分析分别采用6种不同程序包括miRWalk、miRanda、miRDB、Pictar2、RNAhybrid和Targetscan对差异倍数5倍及以上的miRNA进行靶基因预测，结果取其交集；采用Cytoscape 3.8.0软件对得到的miRNA及靶基因进行调控网络可视化，构建miRNA-mRNA调控网络。

1.6 靶基因生物学功能和信号通路分析采用DAVID(Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery)6.8软件对靶基因进行GO(Gene Ontology)生物学功能和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信号通路分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 差异miRNA筛选聚类分析显示，大骨节病与骨性关节炎两组miRNA表达模式明显不同，提示本研究样本制备得当。共124个miRNA在大骨节病软骨下骨中表达显著低于原发性骨关节炎(q-value <0.05, Fold change≤0.5，图1)。其中，8个miRNA差异倍数大于5，分别为hsa-miR-451a、hsa-miR-29c-3p、hsa-miR-192-5p、hsa-miR-363-3p、hsa-miR-629-5p、hsa-miR-17-3p、hsa-miR-182-5p和hsa-miR-486-5p。

2.2 靶基因预测及调控网络构建采用不同程序对8个差异倍数大于5的miRNA进行靶基因预测，预测结果取交集后得到542个靶基因(7个miRNA)，以及1 094个 miRNA-mRNA 调控关系(图2)。

图1 大骨节病和骨性关节炎患者膝关节软骨下骨miRNA表达信号值的散点图

绿色表示下调基因，黑色表示无显著差异基因。

2.3 靶基因GO和KEGG分析结果对542个靶基因进行GO富集分析发现，如表1所示(前5个最显著的 GO Term)，靶基因主要参与RNA聚合酶Ⅱ启动子的转录正调控、神经系统发育和胶原蛋白分解代谢过程等生物学过程；主要涉及细胞核、胶原蛋白三聚物和内质网腔等细胞成分；主要分子功能有细胞外基质结构成分、蛋白结合和转录激活因子活性及RNA聚合酶Ⅱ核心启动子近端区序列特异性结合等。

进一步对靶基因进行KEGG信号通路分析，结合富集基因数及调整后P值，542个靶基因显著富集于20个KEGG通路(correctedP-value<0.05)，如蛋白质消化吸收、黏着斑、PI3K-Akt信号通路、细胞外基质-受体相互作用等(图3)。

图2 miRNA与其靶基因调控网络Fig.2 miRNA and its target gene regulatory network

表1 差异miRNA靶基因GO富集分析结果(Top 5)

图3 miRNA靶基因KEGG富集分析结果

横坐标为-log(校正P值)，纵坐标为KEGG通路名称。

3 讨 论

大骨节病和原发性骨性关节炎均为慢性退行性骨关节疾病，会导致患者不可逆的骨与软骨损伤。在成人大骨节病患者中，关节疼痛和畸形通常发生在肘关节和膝关节等大关节中，这些特征与原发性骨性关节炎患者相似。但两种疾病的发病年龄、症状、X线表现不同，提示其病因机制不同。研究发现，软骨下骨的改变在骨性关节炎发生发展中起重要作用，如在骨性关节炎发生的早期，软骨下骨会出现显微结构的改变，这种结构重塑能够导致软骨损伤的加速[7]。虽然影像学研究发现大骨节病骨及软骨下骨存在的X线改变征象[8-9]，但关于大骨节病软骨下骨分子机制的研究尚未见报道。本研究miRNA表达谱分析显示，大骨节病和骨性关节炎软骨下骨miRNA表达模式不同，提示两种疾病软骨下骨改变的病理机制不同。

有研究比较了大骨节病与骨性关节炎患者外周血样本中的差异表达miRNA，结果发现大骨节病组123个miRNA表达不同于骨性关节炎患者(108个上调和15个下调)，这些差异miRNA靶基因主要涉及低氧、Wnt受体以及维生素B6生物合成等信号通路[10]。本研究中大骨节病软骨下骨与骨性关节炎相比共发现124个下调差异表达miRNA，其中10个miRNA在骨性关节炎患者膝关节软骨下骨硬化区与非硬化区比较也出现下调[11]。其中，部分差异miRNA在骨与软骨发育和完整性中具有重要的调控功能，如靶向SMAD7的miR-17-5p和靶向RUNX2的miR-221被证实与成骨细胞的分化调控有关[12]；miR-30a-5p在骨性关节炎患者软骨中高表达，其能够通过靶向Akt基因抑制细胞周期，从而诱导软骨细胞凋亡[13]。此外，有研究采用高通量测序技术比较了小鼠OA模型与正常对照软骨下骨miRNA表达谱，结果共发现10个差异表达miRNA，如rno-miR-191a-5p、rno-miR-181a-5p等[14]。但由于在研究中正常人软骨下骨样本极难获得，目前尚未见有关正常人软骨下骨miRNA的相关报道。

本研究进一步对差异倍数大于5倍及以上的8个miRNA进行了靶基因预测及其调控网络构建、GO功能注释和KEGG信号通路富集分析，结果显示，这些靶基因参与的部分重要信号通路涉及骨的发育和重塑过程，如PI3K-Akt、MAPK等信号通路。有研究显示，在骨性关节炎小鼠模型中，PI3K-AKT信号通路显著激活，与内侧半月板失稳后胫骨软骨下骨异常骨形成有关，而阻断该通路能够阻止异常骨形成和减轻软骨的退变[15]。已有研究发现，PI3K-Akt信号通路在大骨节病软骨中激活，从而参与大骨节病软骨细胞的凋亡和坏死过程[16]。这些结果有助于认识大骨节病软骨下骨病变的潜在分子机制。

综上所述，本研究发现超过100个miRNA分子在大骨节病和骨性关节炎患者膝关节软骨下骨中差异表达，提示这些分子可能作为区分这两种疾病的分子标志物，为大骨节病与骨性关节炎的鉴别诊断提供了新的依据。通过进一步的生物信息学分析，初步探索了大骨节病患者软骨下骨中miRNA分子的表达改变及其潜在的调控关系。本研究的主要局限在于研究的样本量相对较少，可能影响研究结果的准确性；而且，本研究未能比较大骨节病、骨性关节炎与正常对照软骨下骨miRNA表达的差异情况，不能深入分析大骨节病与骨性关节炎软骨下骨差异表达miRNA在疾病发展中的分子机制。