酪蛋白种类和二次均质工艺对再制稀奶油搅打特性的影响

李 扬，李 妍，王筠钠，袁栋栋，张列兵,

（1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083；2.北京工商大学食品与健康学院，北京 100048）

脂肪质量分数为30%～40%的稀奶油经过搅打后可由水包油的乳液结构转变为泡沫结构，用于蛋糕及咖啡等食品的装饰。稀奶油的搅打过程分为3 个阶段：1）气泡由液相蛋白包裹的快速充气阶段；2）体系中的脂肪球在气泡表面的吸附；3）形成部分聚结的脂肪球网络结构稳定气泡[1]。也有研究认为，稀奶油泡沫并不一定由部分聚结的脂肪球稳定，还可由聚集的脂肪球形成网络结构稳定[2]。将蛋白、乳化剂及油等成分经过均质及灭菌等工艺后制备的稀奶油即为再制稀奶油[3]，这是近年来乳品工业研究的热点之一。搅打特性是再制稀奶油的重要品质之一，受其组成及加工工艺的影响[4-7]。研究发现，蛋白的改性处理及种类的差异会对再制稀奶油的搅打特性产生不同的影响。Sajedi等将乳清蛋白在酸性条件下加热使其预变性后用于制备稀奶油时，可显著改善泡沫的稳定性[8]。Ihara等发现酪蛋白酸钠（sodium caseinate，NaC）及其水解肽质量分数范围均为0.33%～0.66%时对稀奶油泡沫的稳定性无明显影响[9]，而Zhao Qianzhong等发现质量分数在0.3%～0.9%范围内时NaC可改善稀奶油泡沫结构的质构，且其改善作用较乳清蛋白强[10]。在加工工艺方面，Long Zhao等研究报道灭菌强度的增加会对稀奶油的搅打特性产生不利的影响[11]。Bazmi等报道老化时间的延长可在一定程度上增加稀奶油泡沫的稳定性[12]。因此可以看出，虽然关于再制稀奶油搅打特性的研究较多，但因为稀奶油组成及工艺参数的差异导致结果有所不同。

胶束酪蛋白浓缩物（micellar casein concentrate，MCC）是利用膜过滤技术将乳清蛋白去除得到的酪蛋白产品[13]，酪蛋白酸钙（calcium caseinate，CaC）及NaC是另外两种常见的商业酪蛋白产品。三者的区别在于酪蛋白的聚集状态不同，MCC制备过程中胶束结构未被破坏，酪蛋白多以胶束状态存在[14]；而CaC和NaC在制备过程中胶体磷酸钙溶解，酪蛋白胶束解离[15]。本课题组在之前的研究中发现酪蛋白产品的种类和添加量对再制稀奶油稳定性的影响有明显的不同，且其对再制稀奶油稳定性的影响受工艺条件的影响，其中二次均质工艺可改善高蛋白（质量分数2.0%）再制稀奶油的稳定性[3]。但是酪蛋白种类和二次均质工艺对再制稀奶油搅打特性的影响尚不明确。因此，本研究以MCC、CaC及NaC为蛋白原料，以无水黄油为油相制备脂肪质量分数为35.5%的稀奶油。通过测定再制稀奶油的理化性质（粒径、界面蛋白含量及热力学性质）以及搅打特性（起泡率、微观结构及泄漏率）分析3 种酪蛋白产品对再制稀奶油搅打特性的影响。同时考察二次均质工艺对3 种酪蛋白再制稀奶油搅打特性的影响，以期为稀奶油的工业化生产提供更多的技术借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

MCC 美国Leprino公司；CaC、NaC 丹麦Arla公司；无水黄油 产地新西兰；单甘酯 广州美晨公司。

1.2 仪器与设备

APV-1000均质机 丹麦APV公司；LS 230粒径分析仪 美国Beckman公司；K9860凯氏定氮仪 中国海能仪器；DSC-Q200差示扫描量热仪（differential scanning calorimeter，DSC） 美国TA公司；LX-B35L立式电热压力蒸汽灭菌锅 合肥华泰医疗设备有限公司；TCS SP2激光共聚焦扫描显微镜 德国徕卡公司。

1.3 方法

1.3.1 再制稀奶油的制备

图1 再制稀奶油的工艺流程图Fig.1 Flow chart for the preparation of recombined cream

在李扬等[3]报道的方法上略做调整后制备稀奶油，工艺流程如图1所示。称取酪蛋白粉末和去离子水，在65～70 ℃的水浴中搅拌60 min，作为水相。将无水黄油加热至70 ℃以上，称取单甘酯溶于无水黄油中，使其熔化彻底后作为油相。将油相与水相混合后搅拌均匀并定容。样品于70 ℃、9 MPa经过第一次均质后，于121 ℃灭菌7 min，再进行二次均质，二次均质温度和压力分别为80 ℃、6 MPa。再制稀奶油中无水黄油的质量分数为35.5%，单甘酯质量分数为0.4%，酪蛋白质量分数为0.5%、1.5%或2.5%。取灭菌后及二次均质后的样品进行分析，测定再制稀奶油的理化性质以及搅打特性，并通过对比灭菌后及二次均质后稀奶油理化性质及搅打特性的差异分析二次均质工艺的影响。

1.3.2 粒径测定

利用LS 230粒径分析仪的Mie模式测定再制稀奶油的粒径（以表面积平均粒径D3,2表示）。将样品用去离子水稀释10 倍后缓慢滴入样品池，使遮光度处于8%～12%之间。样品折射率和吸收率分别设定为1.460与0.001，分散相折射率设定为1.333。

1.3.3 界面蛋白含量测定

称取10 g再制稀奶油样品于50 mL离心管中，4 ℃ 10 000 r/min离心1 h，取下层清液及沉淀，用凯氏定氮法测定其蛋白质量。界面蛋白含量计算公式如式（1）所示，其中比表面积（specific surface area，SSA）/（m2/g）由LS 230粒径分析仪测定。

式中：m1、m2和m3分别表示再制稀奶油中蛋白的总质量/g、清液及沉淀中的蛋白质量及离心后奶油层的质量/g。

1.3.4 热力学特性测定

利用DSC测定再制稀奶油的热力学特性。称取10 mg样品于铝盒中，并以空铝盒作为对照。于40 ℃保持2 min以消除历史结晶的影响后，以5 ℃/min的速率降至-10 ℃，保温2 min。结晶结束后，以5 ℃/min的速率升至45 ℃。采用TA Universal Analysis软件分析样品的开始结晶温度（TC-onset）、结晶峰值温度（TCmax）、结晶完全熔化温度（TM-end）以及过冷度（ΔT），其中ΔT为TM-end与TC-onset的差值[16]。

1.3.5 搅打特性测定

1.3.5.1 起泡率测定

将再制稀奶油于4 ℃贮存48 h后，取200 g置于不锈钢烧杯中并于低温水浴搅打，前30 s为低速搅打（950 r/min），后改为高速搅打（1 100 r/min），搅打过程中样品温度约在5～7 ℃范围内。根据公式（2）分别计算搅打60、120、180 s及240 s后的起泡率。

式中：m1为搅打前稀奶油的质量/g；m2为搅打后稀奶油泡沫的质量/g。

1.3.5.2 微观结构观察

取200 g再制稀奶油置于不锈钢烧杯中，加入0.02 g/100 mL尼罗红（nile red，NR）和异硫氰酸荧光橙红（fluorescein isothiocyanate，FITC）染液各1.0 mL。待搅打至最大起泡率时立即制片观察。使用配有20×目镜、63×1.4油镜的激光共聚焦扫描显微镜观察样品微观结构。激发光源为Ar灯，NR和FITC的激发光波长均为488 nm，接收波长分别为595～648 nm和500～536 nm。

1.3.5.3 泄漏率测定

取搅打至最大起泡率的稀奶油泡沫5 g置于30 目筛子上，于30 ℃保温120 min后，测定泄漏的乳清质量，泄漏率计算如式（3）所示。

式中：m1为泄漏的乳清质量/g；m2为稀奶油泡沫的质量/g。

1.4 数据处理与分析

利用Excel 2016软件统计数据并绘制图；利用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析，P＜0.05时表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同酪蛋白和二次均质工艺对再制稀奶油粒径的影响

由图2A可知，3 种酪蛋白对再制稀奶油的D3,2有较大的影响。蛋白质量分数相同时，MCC再制稀奶油的D3,2最大，其次为CaC再制稀奶油，NaC再制稀奶油的D3,2最小。对于同种酪蛋白制备的稀奶油，其D3,2随蛋白质量分数的增加而显著下降（P＜0.05），Ye Aiqian也报道过类似结果[17]。再制稀奶油D3,2的大小与酪蛋白的乳化能力有关，MCC的乳化能力较差，其制备的稀奶油的粒径最大。蛋白乳化能力随其质量分数的增加而增加，因此粒径随蛋白质量分数的增加呈下降趋势[3]。对比图2A和2B可知，灭菌后MCC、CaC及NaC再制稀奶油D3,2分别在3.8～6.9、1.7～3.6 μm及1.3～1.7 μm的范围内，经过二次均质后分别降到2.4～3.2、1.6～2.0 μm及1.1～1.3 μm的范围内，可以看出二次均质后所有再制稀奶油的D3,2下降。实验条件下，NaC质量分数为2.5%时制备的稀奶油经过搅打后无法形成稳定的泡沫结构，因此未再对此质量分数的NaC再制稀奶油进行后续研究。

图2 酪蛋白种类和二次均质工艺对再制稀奶油D3,2的影响Fig.2 Effects of casein types and secondary homogenization on the D3,2 of recombined cream

2.2 不同酪蛋白和二次均质工艺对再制稀奶油界面蛋白含量的影响

MCC质量分数为2.5%时，离心后奶油相无法有效分离，界面蛋白含量数据无法测定。由图3A可知，灭菌后再制稀奶油的界面蛋白含量随蛋白质量分数的增加而显著增加（P＜0.05）。蛋白质量分数相同时，MCC再制稀奶油的界面蛋白含量最高，其次为CaC再制稀奶油，NaC再制稀奶油界面蛋白含量最低，如酪蛋白质量分数为0.5%时，MCC、CaC及NaC再制稀奶油界面蛋白含量分别为（9.84±1.57）、（2.68±0.24）mg/m2和（0.94±0.03）mg/m2。界面蛋白含量的差异与酪蛋白中蛋白分子的聚集状态有关，MCC中酪蛋白分子聚集程度最大，有较大的酪蛋白聚集体吸附在油-水界面上，因而导致其界面蛋白含量较高[18]。由图3B可知，再制稀奶油进行二次均质后，MCC和CaC再制稀奶油界面蛋白含量较灭菌后下降（2.5% CaC再制稀奶油除外），NaC再制稀奶油的界面蛋白含量未发生明显的变化。Matsumiya等研究认为，二次均质对界面蛋白含量有重要的影响[19]，这与本研究结果稍有不一致，可以看出二次均质对再制稀奶油界面蛋白含量的影响受酪蛋白质量分数及种类的影响。

图3 酪蛋白种类和二次均质工艺对再制稀奶油界面蛋白含量的影响Fig.3 Effects of casein types and secondary homogenization on surface protein concentration of recombined cream

2.3 不同酪蛋白和二次均质工艺对再制稀奶油热力学特性的影响

脂肪结晶对再制稀奶油的搅打特性有较大的影响。搅打过程中，脂肪结晶可刺破邻近脂肪球的界面膜，促进部分聚结脂肪球的形成[7,20]。本研究利用DSC对再制稀奶油的热力学性质进行分析（图4和表1）。由图4A1、A2可知，灭菌后，MCC再制稀奶油的开始结晶温度（TC-onset）在17.14～17.35 ℃范围内，结晶峰值温度（TCmax）在7.1～7.7 ℃范围内。CaC再制稀奶油的TC-onset和TCmax与MCC再制稀奶油相比无明显差异，但1.5%和2.5% CaC再制稀奶油的最大结晶峰温度分布范围略有增加，说明CaC稀奶油的结晶特性可能发生了变化。NaC再制稀奶油的TC-onset较MCC再制稀奶油低（P＜0.05），在13.19～14.99 ℃范围内；TCmax也有所降低，在5 ℃左右。不同酪蛋白制备的稀奶油的熔化曲线较为类似。升温过程中会出现3 个熔化峰，分别对应低熔点、中熔点及高熔点的组分[5,21]，其中第3个熔化峰的温度范围最大。MCC和CaC再制稀奶油的最大熔化峰的温度范围为17～35 ℃，NaC再制稀奶油的最大熔化峰的温度范围略有增加，在16～35 ℃范围内。由表1可知，所有稀奶油的完全熔化温度（TM-end）差异较小。此外，在室温（25 ℃）时所有稀奶油中仍存在脂肪结晶，这可能对搅打后的稀奶油泡沫的室温储存有一定的帮助[22]。MCC和CaC再制稀奶油过冷度（ΔT）较小，NaC再制稀奶油ΔT较大。本研究中MCC再制稀奶油粒径较大，CaC再制稀奶油粒径次之，NaC再制稀奶油粒径最小，可以看出TC-onset和TCmax随着再制稀奶油粒径的下降而下降，ΔT随粒径的下降呈现增加趋势。在稀奶油体系中，脂肪球粒径越小，则其数量越多，体系中的杂质催化异相结晶的概率越低，需较高的过冷度（ΔT）促进同相结晶[23-24]。

图4 再制稀奶油的结晶和熔化图谱Fig.4 Crystallization and melting profiles of recombined cream

对比图4A1、B1可知，经过二次均质后MCC再制稀奶油结晶曲线与灭菌后的类似，TC-onset无明显变化。CaC再制稀奶油的TC-onset与灭菌后的相比也无明显差别，但最大结晶峰的形状发生了变化，最大结晶峰分裂为两个独立的结晶峰，峰值温度分别在7.8～8.1 ℃和3.3～3.5 ℃的范围内。二次均质后NaC再制稀奶油的TC-onset向低温方向偏移。对比图4A2、B2可知，二次均质后不同酪蛋白制备的稀奶油的熔化曲线与灭菌后的样品类似。再制稀奶油升温过程中也存在3 个熔化峰，最大熔化峰的温度范围及TM-end与灭菌后的相比无明显差异，说明二次均质工艺对稀奶油的熔化特性无明显影响。NaC再制稀奶油的ΔT较灭菌后有所增加，而MCC和CaC再制稀奶油的ΔT无明显变化。综合以上分析，可以看出二次均质对NaC再制稀奶油结晶特性的影响较大，对MCC及CaC再制稀奶油的影响较小。

表1 酪蛋白种类和二次均质工艺对再制稀奶油结晶及熔化特性的影响Table 1 Effects of casein types and secondary homogenization on the crystallization and melting properties of recombined cream

2.4 不同酪蛋白和二次均质工艺对再制稀奶油搅打特性的影响

2.4.1 起泡率

表2 酪蛋白种类和二次均质工艺对再制稀奶油起泡率的影响Table 2 Effects of casein types and secondary homogenization on the foaming rate of recombined cream

起泡率是评价稀奶油搅打特性的关键指标之一[20]。由表2可知，灭菌后，除0.5% MCC再制稀奶油外，其他样品的起泡率随搅打时间的延长先迅速增加后变化较小。0.5% MCC再制稀奶油的最大起泡率为150%左右，MCC质量分数增加至1.5%和2.5%后，最大起泡率分别为（187.9±6.8）%和（171.4±7.9）%。CaC和NaC再制稀奶油的最大起泡率随酪蛋白质量分数的增加呈现不同程度的下降。其中NaC再制稀奶油起泡率随质量分数的变化较为明显，质量分数为0.5%时，再制稀奶油的最大起泡率为（198.2±4.0）%；质量分数为1.5%时，起泡率明显降低，为（119.0±15.4）%，且经过240 s搅打后稀奶油的泡沫仍有一定的流动性，无法形成稳定的泡沫结构。CaC质量分数为1.5%和2.5%时，最大起泡率分别为（187.2±6.8）%和（168.7±7.9）%。起泡率随蛋白质量分数增加而下降，一方面可能是因为脂肪球粒径随着蛋白质量分数的增加而下降，因此搅打过程中脂肪球碰撞几率下降[6]；另一方面可能是因为脂肪球界面蛋白含量随着蛋白质量分数的增加而增加，说明其界面膜的厚度增加，因此搅打过程中脂肪部分聚结率下降[25-26]，从而引起了起泡率的下降。

二次均质后，3 种酪蛋白再制稀奶油的起泡率随搅打时间的变化与灭菌后的变化规律类似。与灭菌后相比，除0.5% MCC再制稀奶油外，其他MCC和CaC再制稀奶油最大起泡率无显著变化（P＞0.05）。NaC再制稀奶油进行二次均质后起泡率变化较大，与灭菌后相比显著下降（P＜0.05），且经过240 s搅打后仍无法形成稳定的泡沫结构。研究认为，再制稀奶油的搅打特性与脂肪球的界面组成及结晶特性密切相关[20]。NaC再制稀奶油灭菌和二次均质后的界面蛋白含量无明显变化，说明其界面膜性质的变化不明显。因此可能是其结晶特性的变化引起的这种结果，二次均质后NaC再制稀奶油的TC-onset下降，其结晶形态或固体脂肪含量可能发生了变化，导致脂肪球部分聚结率下降[27]，因而导致了起泡率的下降。

2.4.2 微观结构

MCC和CaC的质量分数对稀奶油泡沫的微观结构无明显影响，因此以1.5% MCC再制稀奶油、1.5% CaC再制稀奶油为例进行说明。由图5A1、A2可知，灭菌后1.5% MCC和1.5% CaC稀奶油泡沫中气泡数量较多，气泡主要由液相蛋白包裹，气泡膜表面可见吸附的脂肪球。体系中脂肪球多以分散状态存在，无明显的脂肪簇。0.5% NaC稀奶油泡沫中也有较多气泡充入（图5A3），但其微观结构与上述两种稀奶油泡沫的不同，体系中可见较多的脂肪簇，这些脂肪簇可能是部分聚结或聚集的脂肪球。1.5% NaC稀奶油泡沫中的充入气泡数量较少（图5A4），体系中未见明显的脂肪簇。本研究发现3 种酪蛋白稀奶油泡沫的稳定机理可能不同，1.5% MCC和1.5% CaC稀奶油泡沫中脂肪簇较少，此时泡沫的稳定机理可能与皮克林机制类似，由脂肪球通过增加空间位阻或形成三维网络结构稳定泡沫结构[28]，Cao Zhenyu等也报道过类似结果[29]。而NaC稀奶油泡沫可能是由脂肪簇形成的网络结构稳定的，因此1.5% NaC稀奶油泡沫中脂肪簇较少时泡沫结构不稳定。再制稀奶油进行二次均质后，1.5% MCC和1.5% CaC稀奶油泡沫微观结构的变化较小，泡沫中也有较多的气泡充入（图5B1、B2）。0.5% NaC稀奶油泡沫的微观结构与灭菌后样品有明显的不同，泡沫中气泡数量较少（图5B3），体系中未见明显的脂肪球簇。1.5% NaC稀奶油泡沫的微观结构与灭菌后相比也无明显差别，气泡充入数量仍较少，体系中无明显的脂肪簇。微观图像的结果与起泡率的结果相符，可以看出NaC再制稀奶油对二次均质工艺较为敏感。

图5 再制稀奶油泡沫的激光共聚焦显微镜图像Fig.5 Confocal laser scanning micrographs of whipped recombined cream

2.4.3 泄漏率

脱水收缩是稀奶油泡沫主要的去稳定机制[2]，泡沫泄漏率可很大程度上反映稀奶油泡沫的稳定性[30]。由图6可知，灭菌后稀奶油泡沫的泄漏率随酪蛋白质量分数的增加而下降，说明其稳定性有所增加。当MCC和CaC质量分数为1.5%和2.5%时，稀奶油泡沫稳定性良好，泄漏率在0～1.5%内。酪蛋白质量分数相同时，MCC、CaC及NaC稀奶油泡沫的泄漏率无明显差异，说明蛋白质量分数对稀奶油泡沫泄漏率的影响较蛋白种类大。二次均质对MCC和CaC稀奶油泡沫泄漏率的影响较小，而对NaC稀奶油泡沫泄漏率的影响较大。如0.5% NaC稀奶油泡沫灭菌后泄漏率约为12.04%，二次均质后泄漏率大于30%，可能是二次均质后NaC稀奶油泡沫中脂肪球部分聚结率的不同引起的这种差异，Nguyen等也报道了类似的结论[7]。

图6 酪蛋白种类和二次均质工艺对稀奶油泡沫泄漏率的影响Fig.6 Effects of casein types and secondary homogenization on foam leakage rate of recombined cream

综上可以看出，较高蛋白质量分数时，以MCC和CaC为原料制备的稀奶油无论是否进行二次均质，均有良好的搅打特性。而以NaC为原料时，需采用较低的蛋白质量分数且不采用二次均质工艺才可使稀奶油具有良好的搅打特性。

3 结 论

MCC、CaC及NaC再制稀奶油的粒径和界面蛋白含量差异较大，热力学性质差异较小。除1.5% NaC再制稀奶油外，其他再制稀奶油的搅打特性均较好。尤其当蛋白质量分数较高（1.5%和2.5%）时，MCC和CaC再制稀奶油的最大起泡率较高，在170%～200%范围内；且泄漏率极低，在0～1.5%范围内。二次均质后，MCC、CaC及NaC再制稀奶油的搅打特性呈现不同的变化规律。除0.5% MCC再制稀奶油外，其他MCC和CaC再制稀奶油的搅打特性变化不大。而0.5%及1.5% NaC稀奶油经过240 s搅打后仍无法形成稳定的泡沫结构，这可能是因为二次均质后其部分聚结率较低引起的。研究认为，以MCC和CaC为原料制备的稀奶油无论是否进行二次均质，均有良好的搅打特性。