HPLC法同时测定鼠尾草酸、鼠尾草酚和迷迭香酸的含量

林霜霜, 张海峰, 车建美, 葛慈斌

(福建省农业科学院农业生物资源研究所， 福州 350003)

迷迭香(RosmarinusofficinalisL.)是一种重要的香料植物，原产地为欧洲及北非地中海沿岸[1]。目前，迷迭香在贵州、云南、海南、新疆、福建、浙江等多省区广泛种植[2-4]。迷迭香不仅可以作为观赏植物，也是提取香料香精、食品防腐等日化、食品和医药工业的重要原材料[5]。研究表明，迷迭香含有非挥发性成分，如鼠尾草酸、鼠尾草酚和迷迭香酸等，这些多酚类物质具有较强的抗氧化性，鼠尾草酸、鼠尾草酚和迷迭香酸三者总和的抗氧化功效占迷迭香抗氧化功效的90%以上[6-7]，并在抗菌、消炎、抗肿瘤、抗过敏、护肝等方面都有不同程度的生物学活性，是近年来医疗保健开发应用的热点之一[8]。

目前，有关迷迭香活性成分的研究主要侧重于对鼠尾草酸、鼠尾草酚或迷迭香酸3种活性成分含量的检测[2-4，9]，主要检测方法包括紫外分光光度法、气相色谱、高效液相色谱(HPLC)-质谱联用等方法[10-12]。迷迭香植株中鼠尾草酸、鼠尾草酚和迷迭香酸含量的测定常采用HPLC法进行。通过HPLC法检测鼠尾草酸和鼠尾草酚的含量，可以用于核对迷迭香最佳采收期[4,9]，为迷迭香及其提取物的质量控制提供依据[2-3]，还能用于筛选适宜迷迭香愈伤组织成长的LED光质[13]。由于HPLC方法具有快速、准确等优点，所以筛选适宜的HPLC条件对于研究迷迭香中鼠尾草酸、鼠尾草酚和迷迭香酸等成分含量以鉴定不同品种的差异具有重要作用。迄今为止，采用HPLC法同时测定迷迭香中鼠尾草酸、鼠尾草酚和迷迭香酸3种活性成分的检测方法尚未见相关报道。鉴于此，本研究基于HPLC平台建立同时检测迷迭香3种活性成分的方法，旨在为今后迷迭香非挥发性成分的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

4个迷迭香品种为针叶迷迭香(Rosmarinusofficinalis"Pine")、小叶迷迭香(RosmarinusofficinalisL)、大叶迷迭香(Rosmarinusofficinalis"Rex")和赛汶海迷迭香(Rosmarinusofficinalis"Severn Sea")，均在2017年6月份采集于福建省农业科学院亚热带农业研究所芳香植物资源圃。迷迭香的叶和茎提取精油后沥干水分，60 ℃烘干6 h至恒重，分别粉碎过80目筛后，低温(-4 ℃)保存。

1.2 仪器与药品

高效液相色谱：Agilent 1290，美国安捷伦科技公司；高速台式离心机：TGL-10B，上海安亭科学仪器厂(上海飞鸽离心机)；全自动样品氮吹浓缩仪：TurbovapⅡ，美国Biotage公司；C18固相萃取小柱：SPE C18，赛分科技有限公司(Sepax Technologies, Inc)；液相色谱柱：SB-C18，赛分科技有限公司(Sepax Technologies, Inc)。

乙腈为Fisher Chemical公司的色谱纯；无水乙醇为上海国药集团化学试剂有限公司的分析纯。鼠尾草酸：ASOYA-U，东京化成工业株式会社，纯度97.0%；鼠尾草酚：ZZS17061906，上海甄准生物科技有限公司，纯度≥97%；迷迭香酸：ZZS17061907，上海甄准生物科技有限公司，纯度≥98%。

1.3 色谱条件优化

色谱条件参考刘永录等[9]的方法进一步改进。流动相为乙腈(A)+水(B)，梯度洗脱程序为：A：B (60%：40%)，0—10 min；A：B (100%：0%)，20—30 min，其中10—20 min溶剂比例是按照线性变化的。

色谱条件优化：对鼠尾草酸、鼠尾草酚、迷迭香酸标准溶液在200～450 nm进行全波段紫外吸收扫描。确定最大吸收波长，并选择最优检测波长。流速：0.8 mL·min-1。柱温：35 ℃。色谱柱：C18，250 mm×4.6 mm，5 μm。进样量：10 μL。

1.4 迷迭香样品测定

准确称取迷迭香样品1.0 g置于50 mL带盖试剂瓶，用10 mL无水乙醇超声波提取30 min后，2 500 r·min-1离心2 min，上清液氮吹至近干再用5 mL乙腈溶解，4℃ 4 000 r·min-1离心2 min，进一步纯化上清液。

纯化步骤：用适量乙腈活化C18小柱，将上述上清液过C18小柱，收集流出液；再用10 mL乙腈淋洗C18小柱，收集流出液。合并两次流出液，氮吹至近干后，用乙腈溶解并定容至25 mL，上机前过膜(尼龙滤膜，0.45 μm)，然后进样测定。

1.5 对照品溶液的制备

分别准确称取鼠尾草酸、鼠尾草酚和迷迭香酸标准物质20 mg，用适量无水乙醇超声溶解后用无水乙醇定容至20 mL，配制成1 000 mg·L-1的标准储备溶液，避光置于4℃冰箱保存。准确移取适量标准储备溶液，用无水乙醇稀释配制成一系列标准溶液：鼠尾草酸标准工作溶液7、14、28、56、112 mg·L-1；鼠尾草酚标准工作溶液2.5、5、10、20、40 mg·L-1；迷迭香酸标准工作溶液3、6、12、24、48 mg·L-1。标准工作溶液将用于标准曲线的绘制与回收率的测定。

1.6 方法性能验证

精密度测定：按照1.1步骤制备好迷迭香样品，按1.4所述步骤测定试样中鼠尾草酸、鼠尾草酚、迷迭香酸含量，平行测定6次，计算相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)。

稳定性测定：按照1.1步骤制备好迷迭香样品，将其置于室温中(25 ℃)。每间隔4 h取样,按1.4所述步骤测定试样中鼠尾草酸、鼠尾草酚、迷迭香酸含量。

回收率测定：测定添加标准工作溶液后试样中的鼠尾草酸、鼠尾草酚、迷迭香酸含量，计算回收率。

式中，w为回收率；Cp为加标样品实际测试值；Ct为加标样品理论值。

1.7 数据分析

采用Origin Pro8.0进行绘图，SPSS 20.0软件进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

由图1可知，迷迭香酸的最大吸收峰为330 nm，鼠尾草酚在205、280 nm处有吸收，鼠尾草酸在205、230、280 nm处有吸收。鼠尾草酸在205 nm处信号基线不稳定，且杂质物质较多，容易对目标物造成干扰；在280 nm处的摩尔吸光系数较小，响应值低，不灵敏；因此，选择230 nm作为鼠尾草酸检测波长。最终确定迷迭香酸检测波长为330 nm，鼠尾草酚检测波长为280 nm，鼠尾草酸检测波长为230 nm。通过实际样添加标准品试验，上述3种物质响应值良好，色谱峰型尖锐，且与基体物质分离完全，能够准确定性定量检测。图1结果还显示，鼠尾草酸的出峰位置在13.17 min，鼠尾草酚的出峰位置在7.453 min，迷迭香酸的出峰位置在1.732 min。峰形良好，灵敏性高，重现性好。样品中鼠尾草酸、鼠尾草酚和迷迭香酸的峰形及与其他杂峰分离度最为理想。

图1 迷迭香酸、鼠尾草酚、鼠尾草酸的紫外吸收谱及其与迷迭香样品的对比

2.2 线性回归方程与相关系数

从图2可以看出，按色谱条件测定峰面积，以进样浓度(mg·L-1)为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，进行回归计算得线性回归方程为鼠尾草酸：y=16.001x+12.373，R2=0.999 6；鼠尾草酚：y=3.867 2x-0.606 7，R2=0.999 9；迷迭香酸：y=24.28x+0.352 1，R2=0.999 6。

图2 鼠尾草酸、鼠尾草酚和迷迭香酸标准曲线

2.3 精密度试验结果

表1结果显示，3种物质的RSD分别为1.44%、1.44%和2.76%，均低于5%，表明本研究建立的方法精密度良好。

表1 鼠尾草酸、鼠尾草酚和迷迭香酸的精密度试验结果

2.4 稳定性试验结果

表2结果显示，3种物质的RSD分别为1.45%、4.57%和0.96%，均低于5%，含量无明显差别，说明迷迭香样品在室温条件下放置20 h内稳定。

表2 鼠尾草酸、鼠尾草酚和迷迭香酸的稳定性试验结果

2.5 回收率试验结果

回收率试验结果见表3。从表3可知，3种物质的回收率均达到85%以上，表明本研究建立的方法准确可靠。

表3 鼠尾草酸、鼠尾草酚和迷迭香酸的回收率试验结果

2.6 不同品种迷迭香样品测定结果

图3结果显示，4个品种迷迭香叶片和茎中的鼠尾草酸、鼠尾草酚和迷迭香酸的含量差异显著(P<0.05)，不同品种迷迭香叶片中的鼠尾草酸、鼠尾草酚和迷迭香酸的含量明显高于茎中的含量。

注：同一活性成分不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

4个品种迷迭香叶片中鼠尾草酸含量均大于鼠尾草酚和迷迭香酸。针叶迷迭香叶片中鼠尾草酸(25 585.00 mg·kg-1，σ=178.40)和鼠尾草酚含量(11 823.00 mg·kg-1，σ=4)明显高于其他品种。针叶迷迭香叶片中鼠尾草酸含量比赛汶海迷迭香高31.87%，比大叶迷迭香含量高75.44%；针叶迷迭香叶片中鼠尾草酚的含量比小叶迷迭香(10 464.00 mg·kg-1，σ=103)和大叶迷迭香(10 497.00 mg·kg-1，σ=174)叶片中鼠尾草酚含量高12.99%、12.64%，比赛汶海迷迭香(4 130.00 mg·kg-1，σ=19)高186.26%。大叶迷迭香叶片中迷迭香酸含量最高(7 572.67 mg·kg-1，σ=45.09)，鼠尾草酸含量(14 583.00 mg·kg-1，σ=46.09)最低。

小叶迷迭香茎中鼠尾草酸含量(1 570.00 mg·kg-1，σ=13.07)、鼠尾草酚含量(1 603.00 mg·kg-1，σ=39)和迷迭香酸含量(1 304.67 mg·kg-1，σ=56.95)都高于其余3个品种。大叶迷迭香茎中鼠尾草酸含量(710.00 mg·kg-1，σ=26.25)最低，比小叶迷迭香低121.18 %。赛汶海迷迭香茎中的鼠尾草酚(709.00 mg·kg-1，σ=42)和迷迭香酸(774.33 mg·kg-1，σ=26.85)含量最低，与各品种迷迭香茎中的鼠尾草酚和迷迭香酸含量呈显著差异(P<0.05)。

3 讨论

3.1 流动相与梯度程序的选择

目前常规洗脱方式为等度洗脱[2,4,14]，但由于其检测对象仅1～2种，等度洗脱可以满足分离需要。本研究首次使用高效液相色谱同时测定迷迭香中3种抗氧化成分(鼠尾草酸、鼠尾草酚、迷迭香酸)，而等度洗脱无法完全分离被测物，因此采用了梯度洗脱的方式。

3.2 流动相体系及比例的选择

由于迷迭香酸、鼠尾草酸、鼠尾草酚3种物质都具有较好的水溶性[15]，因此筛选甲醇-水或乙腈-水体系作为流动相。由于植物提取液中天然产物众多，在洗脱能力强的体系中各种物质出峰时间集中，目标物质易被干扰，导致定量不准或是产生假阳性。迷迭香酸的出峰位置靠前，如果采用甲醇-水体系，甲醇溶剂峰位置与迷迭香酸出峰位置接近，造成其峰形不对称。因此参考前人研究结果[4,9,16]，采用洗脱能力较弱的乙腈-水体系作为流动相，说明迷迭香酸、鼠尾草酸、鼠尾草酚三者同时测定适宜采用乙腈-水体系。

为保证提取液中各物质得到有效分离，同时尽量缩短分析时间，对初始阶段乙腈不同比例(40%、50%、60%、70%)对分离效果的影响进行试验。结果表明，初始乙腈比例为70%时，迷迭香酸出峰时间过短(<1 min)；初始乙腈比例为40%、50%、60%时，迷迭香酸出峰时间延后(2～3 min)。为缩短分析时间，应选择乙腈的初始比例为60%，并保持10 min，迷迭香酸、鼠尾草酸、鼠尾草酚在10 min内均能出峰，分离良好，且峰形尖锐对称。10 min后将乙腈比例升至100%，并保持10 min，可使其他物质全部流出，避免对下次进样的干扰。本研究所采用的乙腈比例与前人研究结果[4,9,14]一致，说明迷迭香酸、鼠尾草酸、鼠尾草酚同时测定时，适宜采用比例为60：40的乙腈与水体系。

3.3 色谱柱的选择

本研究通过采用C18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)和C8柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)对3种物质的分离比较发现，C18柱的分离效果更好，3种物质的峰形对称、尖锐；C8柱对鼠尾草酸和鼠尾草酚的保留能力较弱，保留时间接近，容易互相干扰。因此，试验中选择C18柱对3种物质进行分离检测，C18柱是目前分离迷迭香酸、鼠尾草酸、鼠尾草酚这3种物质的主流色谱柱[4,9,16-17]。

3.4 固相萃取净化条件的优化

迷迭香成分复杂，可分为脂溶性和水溶性两大类。由于本研究样品已初步提取精油，因此所含挥发性成分和水溶性成分较少，经过乙醇提取后的物质以脂溶性居多。去除脂溶性物质，应选用C18固相萃取柱对迷迭香提取液进行净化。由于乙醇沸点较高，不利于后续浓缩步骤，且对一些无机盐类有一定溶解性。而乙腈对3种物质的溶解性较好，且具有易挥发、对无机盐溶解性差的特点。因此，将乙醇提取液旋蒸至近干，采用乙腈进行溶剂置换和固相萃取净化步骤。

固相萃取净化全过程均采用乙腈作为溶剂，通过研究洗脱溶剂用量对目标物回收率的影响，结果发现，鼠尾草酸出峰时间最晚，因此，以鼠尾草酸为标记物来考察洗脱溶剂用量(5、10和15 mL)对目标物回收率的影响。试验结果表明，一定条件下,洗脱液体积越大，目标物的回收率越高，但同时许多杂质也得不到很好的吸附净化，因此确定本研究选择洗脱液体积为10 mL。目前尚未有文献研究迷迭香固相萃取净化条件的优化，对迷迭香提取物的净化是本研究的创新之处。

3.5 迷迭香中鼠尾草酸、鼠尾草酚和迷迭香酸的含量差异

通过研究鼠尾草酸、鼠尾草酚和迷迭香酸在迷迭香植物里的积累规律可以确定迷迭香的采收日期。李雷鸿等[4]和刘永录等[9]通过研究不同采收期迷迭香中鼠尾草酸和鼠尾草酚含量，分别确定了秋季10月为迷迭香的最佳采收期，其次为6—7月份。

但由于产地不同、品种差异，迷迭香中鼠尾草酸、鼠尾草酚和迷迭香酸含量也都不尽相同，本研究6月在漳州采收定植3年以上的4个品种迷迭香，并对其鼠尾草酸、鼠尾草酚和迷迭香酸含量进行测定。结果显示，针叶迷迭香叶片中鼠尾草酸和鼠尾草酚含量明显高于其他品种，大叶迷迭香叶片中迷迭香酸含量最高，小叶迷迭香茎中鼠尾草酸、鼠尾草酚和迷迭香酸含量都高于其余3个品种。本研究中6月份采收的针叶迷迭香鼠尾草酸含量高于10月份采收的浙江富阳药用植物种植基地迷迭香中的鼠尾草酸含量[4]，低于6月份采收的河南禹州市森源本草天然产物有限公司药用植物GAP生产基地种植的迷迭香中鼠尾草酸含量[9]，6月份采收的针叶迷迭香鼠尾草酚含量高于同月份采收的河南禹州产迷迭香[9]。因此，含量差异可能与种植水平、产地、品种和定植时间有关。