基于ITS 序列位点特异性PCR 鉴别北柴胡掺伪藏柴胡

赖 晶，史中飞，宋平顺，王子夏，倪 琳，滕宝霞

(甘肃省药品检验研究院，甘肃 兰州 730013)

在2020 年版《中国药典》（一部）中规定柴胡为伞形科植物柴胡Bupleurum chinense DC.和狭叶柴胡B.scorzonerifolium Wild.的干燥根，根据性状不同，前者习称“北柴胡”，后者习称“南柴胡”[1]。柴胡作为大宗中药材，有疏肝、升阳的功能，有保肝、解热、抗肿瘤等药效。根据《中国植物志》记载，我国柴胡属有36 种，17 变种，7 变型[2]。柴胡属植物不仅种类较多，分布广泛，不同产地均有作为柴胡药用的习性，而且性状特征较为相似，使得采集和使用时难以鉴别，以致出现混伪品与正品柴胡的混用现象。藏柴胡作为柴胡属变种之一，其来源于伞形科植物窄竹叶柴胡Bupleurum marginatum Wall. ex DC. var.stenophyllum（Wolf）Shan et Y. Li 的干燥根，主产于云南、四川、贵州、西藏等部分地区[3]。藏柴胡价格低，常作为北柴胡掺伪药材之一，因此建立快速、稳定鉴别藏柴胡的方法尤为重要。DNA 分子指纹图谱作为中药材鉴别的方法之一，具有微观或化学成分所无法达到的特异性。本实验基于ITS 通用引物对样品进行测序，用DNAMAN 软件对测序序列及NCBI 中部分序列进行比对，根据藏柴胡的SNP 位点设计鉴别引物并对特异性PCR 反应条件进行优化，从而建立一种快速、稳定鉴别北柴胡中掺伪藏柴胡的分子生物学检测方法。

1 材料与方法

1.1 仪器

VeritiTM 96-Well 型PCR 仪、Legend Micro 21R型高速冷冻离心机、Nano Drop2000 型微量核酸定量仪（美国赛默飞世尔科技公司）；Sub Cell® GT 型电泳仪（美国伯乐公司）；Geldoc-It2 315 型凝胶成像系统（美国UVP 公司）。

1.2 药材与试剂

柴 胡 标 准 药 材（ 北 柴 胡， 批 号：120992-201509）购于中国食品药品检定研究院。收集15 份样品（北柴胡10 份、藏柴胡5 份），经甘肃省药品检验研究院宋平顺检验师鉴定。Plant Genomic DNA Kit 200 preps 植物基因组DNA 提取试剂盒，D2000 DNA Marker ，2 × Taq PCR MasterMix，2 × Taq Plus PCR Mix，50 × TAE [天根生化科技（北京）有限公司]；2 × Taq PCR StarMix（北京康润诚业生物科技有限公司）；琼脂糖（美国Invitrogen 公司）；GelRed （美国Biotium 公司）。样品信息见表1。

1.3 方法

1.3.1 基因组DNA 的提取 取适量样品粉碎，采用植物基因组DNA 提取试剂盒提取样品总DNA，调整质量浓度于5 ng/μL，作为供试品DNA 模板，于-20 ℃保存备用。

1.3.2 ITS 片段扩增与测序 各样品采用ITS 通 用 引 物 进 行 扩 增[4]，ITS5（F）: 5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'；ITS 4（R）:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。PCR 反 应 体 系总体积为20 μL，包括2×Taq PCR MasterMix 10 μL，正反引物各1 μL，DNA 模板5 μL，无菌水补足至20 μL。反应条件为94 ℃ 5 min，35 个循环（ 94 ℃30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min），72 ℃ 5 min。产物由北京天一辉远生物公司测序，各样品均采用正反双向测序，以保证结果的准确性。

表1 样品信息Tab. 1 Information of samples

1.3.3 位点特异性鉴别引物设计 根据NCBI 中查找的北柴胡和藏柴胡ITS 序列用DNAMAN 软件进行比对分析。用Premier Primer 5.0 软件针对藏柴胡的特异性变异位点设计特异性鉴别引物，由北京华大基因生物公司合成。引物序列为BmF：5'-GCTCCTCGGCCCAAATAT-3'，BmR：5'-GATGGCAAGAGGTTAGTAGT-3'。

1.3.4 PCR 扩增条件的优化 用1、2、10、11、12 号样品对特异性鉴别引物进行PCR 扩增反应，为获得最适特异性PCR 反应条件，分别考查退火温度（59、61、63、65、67 ℃）、不同引物量（0.2、0.3、0.4 μL）、循环数（25、30、35 个循环）、不同酶（2 ×Taq Plus PCR Mix、2×Taq PCR StarMix）对PCR 扩增的影响。

1.3.5 电泳 用1%的琼脂糖电泳检测PCR 扩增产物，在130 V 电压的条件下电泳约50 min，然后利用凝胶成像分析仪拍照。

2 结果分析

2.1 退火温度的考查

分别对59、61、63、65、67℃ 5 个退火温度进行考查。退火温度为59、61℃时，有假阳性条带出现；退火温度上升至63、65℃时，藏柴胡有清晰的特异性扩增条带，北柴胡则无条带；退火温度升高至67℃时，藏柴胡与北柴胡均未扩增出条带。为保证PCR 有良好的重复性，采用65℃作为此方法的退火温度，结果如图1 所示。

图1 不同退火温度下PCR 电泳图Fig. 1 PCR electrophoresis of different annealing temperatures

2.2 循环参数的考查

分别对25、30、35 个扩增循环参数进行考查。25、35 个循环时，藏柴胡有清晰的特异性扩增条带，且无假阳性条带；35 个循环时，出现假阳性条带。为保证扩增的稳定性及区分度，选择30 个循环作为扩增循环参数，结果如图2 所示。

图2 不同循环数PCR 电泳图Fig. 2 PCR electrophoresis of different cycles

2.3 不同引物量的考查

分别对0.2、0.3、0.4 μL 上、下游引物BmF 和BmR（10 μmol/L）进行考查。当加入0.2 μL 引物时，藏柴胡可以扩增出条带，但条带亮度较弱；随着引物量增大，藏柴胡扩增条带亮度随之变亮。考虑扩增的稳定性，本实验采用0.4 μL 的引物量，结果如图3所示。

图3 不同引物量PCR 电泳图Fig. 3 PCR electrophoresis of different primer quantities

2.4 不同酶的考查

除上述方法中使用的聚合酶2×Taq PCR MasteMix 外，本 实 验 对2×Taq Plus PCR Mix 酶 和2×Taq PCR StarMix 酶2 种聚合酶进行考查。这两种酶均能扩增藏柴胡，而不能扩增北柴胡，说明特异性引物适用于多种酶，无单一局限性，结果如图4 所示。

图4 两种不同酶PCR 电泳图Fig. 4 PCR electrophoresis of two different enzymes

2.5 重现性考查

用样品信息表中的所有样品对PCR 反应体系及反应条件进行重现性考查。反应体系为20 μL，其中包括2×Taq PCR MasterMix 10 μL，正反向引物0.4 μL，DNA 模 板1 μL，无 菌 水 补 足 至20 μL；反应条件为：94 ℃ 3 min，30 个循环（94 ℃ 30 s，65 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s），72 ℃ 3 min。藏柴胡均能扩增出425 bp 特异性条带，而北柴胡均无条带，结果如图5 所示。

图5 扩增条件及体系重现性PCR 电泳图Fig. 5 PCR electrophoresis of amplification conditions and system reproducibility

2.6 掺伪检出限考查

为考查该特异性PCR 扩增对北柴胡中掺伪藏柴胡的鉴别能力。按不同的比例将藏柴胡掺于北柴胡中，充分混匀，即可得到掺有0%（北柴胡）、1%、3%、5%、10%、25%、50%、75%、100%（藏柴胡）的混合样品，使用上述方法提取DNA 并进行该特异性PCR 扩增。北柴胡样品中掺有1%以上藏柴胡时均可检出，结果如图6 所示。

图6 北柴胡中掺加不同比例藏柴胡的位点特异性PCR 电泳图Fig. 6 PCR electrophoresis of Bupleurum chinense mixed with different proportions of Bupleurum marginatum var. stenophyllum

3 讨论

DNA 条形码技术在生物学分类和鉴定中得到了广泛应用。目前在药用植物中可作为DNA 条形码的序列包括ITS （internal transcribed spacer）、ITS2（intemal transcribed spacer 2）、rbcL （ribulose bisophosphate carboxylase）、matK （megakaryocyteassociated tyrosine kinase）等[5]。ITS 序列是位于核糖体DNA（rDNA）上具有高度重复，各位点间协同进化，区分物种能力强的一段序列。在被子植物中，ITS 序列长度600 ～ 700 bp，适用于属、种的鉴定[6]。随着PCR 技术成为国内外分析DNA 的主要手段，分子鉴定中药材有了更广阔的前景。刘力等[7]利用DNA 芯片技术对6 种柴胡属植物来源的生药进行鉴别。DNA 测序聚类分析也是作为柴胡鉴别的方法之一。郝媛媛等[8]利用AFLP 揭示了柴胡种质资源的遗传差异。XIE H 等[9]对中国市场的36 种柴胡属药材应用ITS 进行同源性分析鉴别。

位点特异性PCR 已成为用于鉴别方法之一，具有稳定、易操作且满足实际需求的优点。如李桂林等[10]通过位点特异性性PCR 实现了酸枣仁扩增出66 bp的条带，而混伪品未扩增出条带。高琳惠等[11]通过位点特异性PCR 证明了桃仁能扩增出333 bp 的条带，苦杏仁没有该条带。赵丹等[12]在特异性PCR 方法的基础上通过荧光显色鉴别太子参及其混伪品。本实验通过收集北柴胡和藏柴胡样品，基于ITS 序列设计藏柴胡鉴别引物，结果表明其引物特异性较好，鉴别能力高，可作为北柴胡与藏柴胡的鉴别引物。

4 结论

本实验通过设计特异性鉴别引物并对PCR 扩增条件进行了一系列考查，最终得到稳定、可重复的鉴别藏柴胡特异性PCR 方法和体系。此外本实验研究发现北柴胡掺伪藏柴胡的检出限为1%，考虑到实验过程中取样的实际情况和实验结果的准确性，该方法只能定性检测北柴胡中是否掺有藏柴胡，不能作为掺伪藏柴胡DNA 的定量分析。