葫芦茶苷对大鼠肝星状细胞增殖和细胞外基质的影响及机制研究

唐爱存，俞 渊，罗 远，卢秋玉，王 兵

（1.广西中医药大学第一附属医院 科研部，广西 南宁 530023；2.广西壮瑶药工程技术研究中心，广西 南宁 530200；3.广西壮族自治区人民医院 药学部，广西 南宁 530021）

肝纤维化是由多种原因引起的慢性肝损害所致的病理改变，现代医学研究发现肝纤维化是由于细胞外基质的增殖与降解失去平衡而导致纤维结缔组织在肝脏内异常沉积的病理过程，肝星状细胞（HSC）的活化是肝纤维化形成的最终共同途径，并且是肝纤维化发生发展的关键环节，研究表明HSC 的活化和转化在肝纤维化中起着关键作用[1-2]。肝纤维化是慢性肝病发展到肝硬化以及肝癌的必经阶段。目前在诊治方面虽然有一些进展，但仍缺乏确定有效的药物。因此，阻断细胞因子的促增殖作用有望成为治疗肝纤维化的有效措施。

葫芦茶苷是从中草药葫芦茶中提取分离得到的活性成分，前期研究发现[3-6]，葫芦茶苷具有保肝作用，而且体外对乙型肝炎病毒具有很强的抑制作用。本课题组近期研究发现葫芦茶苷对CCl4诱导的小鼠肝纤维化具有明显的保护作用，其机制可能通过清除自由基和炎性反应，抑制胶原合成与沉积，减轻肝星状细胞的活化[7]。为进一步探讨葫芦茶苷在体外的抗肝纤维化作用，本实验以大鼠肝星状细胞为体外细胞模型，从细胞增殖、细胞外基质的合成和沉积以及相关蛋白的表达方面探讨其可能机制，以期为深入研究开发葫芦茶抗肝纤维化提供理论基础和实验依据。

1 材料

1.1 药品与试剂

葫芦茶苷样品（纯度＞98.0%）由本课题组从葫芦茶Tadehagi triquetrum （L.） Ohashi 中分离而得，采用无血清高糖DMEM 培养基配成浓度为500 μg/mL母 液， 4 ℃保 存 备 用。 秋 水 仙 碱 片（ 批 号：20181001，规格：0.5 mg，广东彼迪药业有限公司）；高糖DMEM 培养基（CatNO13200 035，美国Gibco公司）；胎牛血清（CatNO16000 036，海克隆），胰蛋白酶（美国Amersco 公司）；PBS（LotNO40903060T，福州迈新生物技术开发有限公司）；CCK 8 试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；Trizol 试剂（美国Invitrogen 公司）；First Strand cDNA Synthesis Kit（批号：00064478，美国MBI 公司）；琼脂糖（批号：17065318，西班牙Biowest 公司）；2×PCR TaqMix（批号：9108，日本Takara 公司）；RIPA 裂解液（含1%蛋白酶抑制剂）、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），Hyp、HA、TIMP 1 检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，其它试剂均为分析纯。

1.2 细胞株

HSC T6 细胞株购自中国科学院细胞库，为SV40转染SD 大鼠HSC，其表型为活化的HSC，表达高水平的I 型胶原，本研究室自行培养传代。

1.3 仪器

Model 311 型CO2孵箱（美国Thermo Forma 公司）；Model 450 型自动酶标仪（美国Bio Rad 公司）；XD 101 型倒置显微镜（南京江南光电集团股份有限公司）；722 型可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；PAC 300 型低压电泳仪、ABI 9700 型聚合酶链反应（PCR）扩增仪、HD 4N 型核酸蛋白测定仪（美国Bio Rad 公司）；Tanon 5200 型全自动化学发光图像分析系统（上海天能科技有限公司）。

2 方法

2.1 细胞培养

采用含10%胎牛血清的高糖DMEM 作为培养液，将HSC T6 细胞置CO2培养箱（37 ℃，5% CO2）中培养，8 h 即可贴壁生长，每天观察细胞生长情况，每两天更换一次细胞培养液，细胞长满后，采用0.25%胰酶消化传代。

2.2 CCK 8 法检测葫芦茶苷对HSC T6 增殖的影响

将对数生长期的HSC T6 细胞经0.25% 胰蛋白酶消化后，用完全培养液将细胞浓度调至 1 × 104/mL细胞悬液，加入96 孔培养板中，每孔200 μL，每个浓度设6 个复孔，置CO2孵箱（37 ℃，5% CO2）中培养。24 h 后细胞贴壁且生长良好，吸除全部培养液，加入6 个终浓度分别为10、20、40、80、160、320 μg/mL 的葫芦茶苷药液，并设置空白对照组，连续培养24 h 后，每孔加入10 μL CCK 8，混匀后培养箱中孵育 2 h，采用自动酶标仪（检测波长为450 nm）读取各孔OD 值，并计算不同药物浓度对HSC T6 细胞的增殖抑制率。

2.3 ELISA 法检测细胞上清液Hyp、HA 和TIMP 1的含量

将对数生长期的HSC T6 细胞接种于96 孔培养板中，每孔200 μL，置 CO2孵箱（37 ℃，5%CO2）中培养。24 h 后细胞贴壁且生长良好，吸除全部培养液。分别设置空白对照组、阳性对照组（秋水仙碱 6.25 μg/mL）、葫芦茶苷剂量组（20、40、80 μg/mL），每个浓度设 6 个复孔，置CO2孵箱 （37℃，5% CO2）中继续培养24 h 后，收集各组细胞上清液，分别按照试剂盒说明书采用ELISA 法测定细胞上清液中Hyp、HA 和TIMP 1 的含量。

2.4 FQ PCR 法检测细胞内Col I、TGF β1、α SMA和PDGF BB mRNA 的表达

按照“2.3”项下的细胞分组与给药，连续培养24 h 后，弃去上清液，收集各组细胞，采用 Trizol 一步法提取细胞总RNA，再由RNA 反转录成 cDNA，进行 qPCR 检测，以β actin 为内参，各基因引物序列见表1。FQ PCR 反应体系为1 μL cDNA 模板，10 μL ddH2O，8 μL SYBR Premix Ex TaqTM 和上、下游引物各0.5 μL，总反应体系为20 μL，并保证所有反应体系的组成（如酶浓度、引物浓度等）一致。反应条件为95℃预变性5 min；95℃变性10 s， 56℃退火20 s，72℃延伸20 s，共反应55 个循环，最后在72℃延伸5 min。结果采用比较2-△△CT法分析各基因在细胞中表达的相对含量。

表1 基因引物序列表Tab. 1 The table of gene primer sequence

2.5 Western blot 法检测细胞内TGF β1、α SMA 和PDGF BB 蛋白的表达

按照“2.3”项下的细胞分组与给药，连续培养24 h 后，弃去上清液，收集各组细胞，用RIPA 裂解细胞得总蛋白。采用二喹啉甲酸（BCA）法定量蛋白浓度，用10%十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶（SDS PAGE）进行蛋白质的电泳分离，然后再转移到硝基纤维素膜上，50 g/L 脱脂奶粉封闭液封闭1 h，分别加入兔抗鼠TGF β1、α SMA 、PDGF BB 和内参β actin 多克隆抗体（1 ∶1 000），4 ℃孵育过夜，TBST 缓冲液洗膜 3 次，再加入二抗室温孵育2 h 后，用TBST 缓冲液清洗，以ECL 显色后，置于全自动化学发光图像分析系统上成像。以目标蛋白与内参β actin 条带的灰度值比值来表示目标蛋白的表达水平。

2.6 统计学方法

用SPSS 19.0 软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t 检验。以P ＜0.05 为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 葫芦茶苷对HSC T6 细胞增殖的影响

与空白组比较，葫芦茶苷各剂量组均能抑制HSC T6 细胞的增殖，差异具有统计学意义（P ＜0.05或P ＜0.01），且随着给药剂量的增加，肝星状细胞被抑制效果越明显，结果见表2。根据实验结果，以浓度为20、40、80 μg/mL 作为后续实验的给药剂量。

表2 葫芦茶苷对HSC T6 细胞增殖的影响（±s，n ＝ 6）Tab. 2 Effect of Tadehaginoside on the proliferation of HSC T6 cells（±s，n ＝ 6）

表2 葫芦茶苷对HSC T6 细胞增殖的影响（±s，n ＝ 6）Tab. 2 Effect of Tadehaginoside on the proliferation of HSC T6 cells（±s，n ＝ 6）

注：与空白对照组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01

组别 浓度/（μg/mL） OD 值 抑制率/%空白对照组 - 0.557 ± 0.056 0葫芦茶苷不同剂量组10 0.483 ± 0.044* 13.29 ± 1.56*20 0.375 ± 0.040** 32.68 ± 3.71**40 0.326 ± 0.031** 41.47 ± 5.02**80 0.245 ± 0.017** 56.01 ± 5.97**160 0.208 ± 0.011** 62.66 ± 6.85**320 0.192 ± 0.010** 65.53 ± 7.13**55.253 38.655 0.005 0.007 F P

3.2 葫芦茶苷对细胞上清液Hyp、HA、TIMP 1 含量的影响

结果显示， 葫芦茶苷各剂量组均能降低HSC T6细胞上清液中Hyp、HA 和TIMP 1 的含量，与空白组比较，差异均有统计学意义（P ＜0.05或P ＜0.01），但与秋水仙碱组比较，差异无统计学意义（P ＞0.05），详见表3。

表3 葫芦茶苷对细胞上清液Hyp、HA、TIMP 1 含量的影响（±s，n ＝ 6）Tab. 3 Effect of Tadehaginoside on Hyp, HA and TIMP 1 content in cell supernatant（±s，n ＝ 6）

表3 葫芦茶苷对细胞上清液Hyp、HA、TIMP 1 含量的影响（±s，n ＝ 6）Tab. 3 Effect of Tadehaginoside on Hyp, HA and TIMP 1 content in cell supernatant（±s，n ＝ 6）

注：与空白对照组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01

TIMP 1/（pg/mL）空白对照组 - 11.75 ± 1.82 156.34 ± 17.35 2 867.23 ± 182.55秋水仙碱组2 60.25 7 9..34 62 ±± 10..0964*** 110112..6023 ±± 1123..4006****22 36 6491..43 45 ±±115739..2457***40 8.58 ± 0.81** 96.74 ± 10.58** 2 506.77 ± 148.06**80 6.71 ± 0.90** 87.07 ± 9.64** 2 382.12 ± 137.99**35.227 30.899 24.188 0.008 0.009 0.009葫芦茶苷低剂量组组别 浓度/（μg/mL）Hyp/（μg/mL）HA/（ng/mL）葫芦茶苷高剂量组葫芦茶苷中剂量组F P

3.3 葫芦茶苷对细胞内Col I、TGF β1、α SMA、PDGF BB mRNA 表达的影响

FQ PCR 结果表明，与空白组比较，葫芦茶苷各剂量组能降低HSC T6 细胞内Col I、TGF β1、α SMA、PDGF BB mRNA 的表达，差异具有统计学意义（P ＜0.05 或P ＜0.01），但与秋水仙碱组比较差异无统计学意义（P ＞0.05），详见表4。

3.4 葫芦茶苷对细胞内 TGF β1、α SMA 和PDGF BB 蛋白表达的影响

Western blot 结果显示，葫芦茶苷各剂量组能下调细胞内TGF β1、α SMA、PDGF BB 蛋白的表达，与空白组比较，差异均有统计学意义（P ＜0.05 或P ＜0.01），但与秋水仙碱组比较，差异无统计学意义（P ＞0.05），详见图1、表5。

表4 葫芦茶苷对细胞内Col I、TGF β1、α SMA、PDGF BB mRNA 表达的影响（±s，n = 6）Tab. 4 Effects of Tadehaginoside on the expression of Col I, TGF 1,SMA, PDGF BB mRNA（±s，n = 6）

表4 葫芦茶苷对细胞内Col I、TGF β1、α SMA、PDGF BB mRNA 表达的影响（±s，n = 6）Tab. 4 Effects of Tadehaginoside on the expression of Col I, TGF 1,SMA, PDGF BB mRNA（±s，n = 6）

注：与空白对照组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01

Col I TGF β1 α SMA PDGF BB空白对照组 - 1.00 ± 0.05 1.00 ± 0.06 1.00 ± 0.05 1.00 ± 0.08秋水仙碱组 6.25 0.65 ± 0.09** 0.57 ± 0.08** 0.71 ± 0.09** 0.69 ± 0.10**葫芦茶苷低剂量组组别 浓度/（μg/mL）20 0.87 ± 0.11* 0.80 ± 0.10* 0.90 ± 0.13* 0.85 ± 0.13*葫芦茶苷中剂量组40 0.73 ± 0.08** 0.69 ± 0.09** 0.75 ± 0.12* 0.78 ± 0.09*葫芦茶苷高剂量组80 0.58 ± 0.07** 0.60 ± 0.07** 0.66 ± 0.09** 0.59 ± 0.08**F 85.023 75.695 80.055 78.951 P 0.003 0.004 0.003 0.004

图1 葫芦茶苷对TGF β1、α SMA 和PDGF BB 蛋白表达的影响Fig. 1 Effects of Tadehaginoside on TGF 1, α SMA and PDGF BB protein expression

表5 葫芦茶苷对TGF β1、α SMA 和PDGF BB 蛋白表达的影响（±s，n = 6）Tab. 5 Effects of Tadehaginoside on TGF 1, α SMA and PDGF BB protein expression（±s，n = 6）

表5 葫芦茶苷对TGF β1、α SMA 和PDGF BB 蛋白表达的影响（±s，n = 6）Tab. 5 Effects of Tadehaginoside on TGF 1, α SMA and PDGF BB protein expression（±s，n = 6）

注：与空白对照组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01

（μg/mL） TGF β1/β actin α SMA/β actin PDGF BB/β actin空白对照组 - 1.062 ± 0.155 0.806 ± 0.106 1.388 ± 0.165秋水仙碱组 6.25 0.569 ± 0.085** 0.529 ± 0.075** 0.632 ± 0.079**葫芦茶苷低剂量组 20 0.813 ± 0.011* 0.725 ± 0.091* 0.827 ± 0.103*葫芦茶苷中剂量组 40 0.601 ± 0.079** 0.624 ± 0.081** 0.753 ± 0.099**葫芦茶苷高剂量组 80 0.578 ± 0.084** 0.591 ± 0.075** 0.665 ± 0.083**F 36.816 52.933 42.186 0.007 0.005 0.006 P组别 浓度/

4 讨论

目前研究认为肝纤维化主要是由ECM 引起的，ECM 在肝脏中过量产生和沉积，打破了细胞外基质增殖和降解的平衡[8]，其中肝星状细胞（HSCs）是慢性肝病中ECM 增加的主要来源，肝星状细胞的激活导致各种肝损伤，同时分泌Hyp、HA、TIMP 1、TGF β1、α SMA 和PDGF BB，继续激活肝星状细胞[9]，因此，抑制肝星状细胞的活化和增殖，诱导活化的肝星状细胞凋亡被认为是可能的抗纤维化策略。

TGF β1 通过促进HSCs 向肌成纤维细胞转化，刺激ECM 的合成并抑制其降解，从而导致HSC 永久活化，而HSC 细胞活化后可转化为肌成纤维细胞，肌成纤维细胞表达高水平的TGF β1，进一步诱导静止的HSCs 向肌成纤维细胞转分化并增殖。因此，TGF β1 是导致肝纤维化最强的细胞因子，通过抑制TGF β1 的产生或阻断其生物活性来抑制HSC 的激活，被认为是治疗抗纤维化的重要靶点[10]。

5 结论

本研究以大鼠肝星状细胞为体外细胞模型，从细胞增殖、细胞外基质的合成和沉积以及相关蛋白的表达方面探讨葫芦茶苷抗肝纤维化作用机制，研究证实葫芦茶苷体外具有抗肝纤维化作用，其机制可能与抑制HSC T6 细胞的增殖，下调TGF β1、α SMA和PDGF BB 蛋白的表达，从而减少肝细胞外基质Hyp、HA、TIMP 1 的合成和沉积有关。