中药调控脑缺血后海马内源性神经发生与修复的研究进展*

高家乐，姚明江，刘建勋

(中国中医科学院西苑医院基础医学研究所中药药理北京市重点实验室，北京 100091)

脑卒中指各种因素引起脑内动脉狭窄、闭塞或破裂，造成急性脑血液循环障碍及脑部供血受阻，继而导致脑功能障碍，约80%的脑卒中是由于缺血性因素引起[1]。脑卒中作为多发常见的重大疾病，不仅是全球第五大死亡原因，也是导致成年人残疾的主要原因，脑卒中后遗症严重影响着患者的健康和生活，然而目前仍然没有神经保护剂作为抗缺血性脑卒中药物被认可，无论是已上市的药物还是常用的治疗方法都不能促进脑卒中后的神经修复和神经发生[2-3]，卒中后神经修复的机制与方法亟待研究。成年海马神经发生与学习和记忆等认知功能有关，神经发生受阻会导致认知和情绪障碍[4]，脑缺血会引起海马损伤，认知功能受缺陷，严重的发展为血管性痴呆。海马齿状回(dentate gyrus，DG)颗粒下区(subgranular zone，SGZ)是成年哺乳动物脑内神经发生的主要位点之一，成年期可以不断地产生新的神经元，有助于学习和记忆功能的维持[5]。

中药具有多成分、多靶点、多层次、多途径的综合优势，通过改变神经干细胞的微环境以及调控内源性因素等来调节神经干细胞的增殖和分化，能够促进神经发生[6-7]。笔者总结成年海马神经发生的机制及过程、海马颗粒下区神经干细胞微环境对神经发生的影响以及中药在防治脑缺血过程中对海马的调控作用，以期为中药促进脑缺血后海马内源性神经发生与修复的相关研究提供参考。

1 海马神经发生机制及过程

神经干细胞(neural stem cell，NSC)具有自我更新的能力，可以分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，以构建和维持大脑结构和功能单位[8]，在胚胎发育和成年神经发生过程中起着重要作用。神经发生是对局灶性脑缺血的一种反应，脑缺血能够激活海马SGZ的神经干细胞，促进神经发生[9]。海马SGZ成年神经干细胞在发育为新生的颗粒神经元并功能性整合入海马回路之前，会经历几个连续的发育阶段，包括增殖、分化、迁移、轴突延伸和突触整合[10]，受到一系列信号的调控。在不同发育阶段，细胞类型有Ⅰ型细胞、Ⅱa型细胞、Ⅱb型细胞、Ⅲ型细胞以及未成熟和成熟的神经元，其中Ⅰ型细胞是海马SGZ中具有NSC特性的放射状胶质样细胞(radial glia-like cells，RGLs)，表达巢蛋白(nestin)，可产生具有瞬时扩增特性的Ⅱ型中间神经祖细胞(neural progenitor cells，NPCs)，增殖能力增强，其又可以分为IIa和IIb两种亚型，双皮质素(doublecortin，DCX)和巢蛋白均呈阳性，这些Ⅱ型细胞可以产生Ⅲ型迁移神经母细胞，特征为DCX阳性、巢蛋白阴性以及多唾液酸型神经细胞黏附分子阳性，迁移到颗粒细胞层，在成熟之前扩增随后退出细胞周期，进入短暂的有丝分裂后阶段，形成未成熟的神经元，再过2～3周期后转化为成熟的新生颗粒神经元[11-12]，将轴突投射到海马CA3区，树突投射到海马DG的分子层以接受兴奋性突触输入[13]。除了神经元的产生外，还能产生少量胶质细胞如星形胶质细胞等。海马内嗅皮层经过DG、CA3和CA1区构成三突触神经回路，海马齿状回成年新生神经元的增加不仅有助于三突触神经回路的可塑性，而且提供了海马结构和功能的可塑性[14]，海马神经回路及细胞类型见图1。

图1 海马三突触回路及细胞类型简图

2 海马SGZ区神经干细胞微环境对神经发生的影响

神经干细胞微环境主要包括与神经干细胞相邻的细胞、细胞因子、细胞外基质和微血管网等，海马SGZ区微环境细胞组成主要包括星形胶质细胞、神经元以及增殖细胞[15]。星形胶质细胞在脑缺血后的神经发生与修复中起着双向作用。一方面，在脑缺血发生后几分钟内，缺血核心区和半暗区带产生肿瘤坏死因子(TGF)-α、白细胞介素(IL)-1、IL-6等因子，触发星形胶质细胞的活化，引起反应性星形胶质细胞增生，形成胶质瘢痕，阻碍轴突再生，还能产生促炎因子，增加炎症反应等[16]，不利于神经发生；而另一方面，星形胶质细胞也能分泌和释放一些趋化因子和生长因子，到达神经发生位点，促进神经祖细胞增殖、迁移到达缺血区[17]，另外星形胶质细胞本身也能转分化为神经元。SHEN等[18]研究表明，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)通过增加巢蛋白和Pax6的表达促进成年大鼠缺血损伤纹状体中的反应性星形胶质细胞向神经干细胞转化，进一步增强反应性星形胶质细胞分化为新的成熟神经元，从而促进神经发生。ASRICAN等[19]研究发现，海马齿状回胆囊收缩素(cholecystokinin，CCK)中间神经元释放一种内源性神经肽即CCK。CCK释放增加能够促进星形胶质细胞谷氨酸递质的释放，进而激活放射状胶质神经干细胞中的丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶1信号，促进神经干细胞的稳定增殖和分化。

细胞因子有成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)、VEGF、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)等。FGF参与血管生成，具有促进神经发生和突触生成，保护神经元并促进神经元的存活等功能[20]，其中FGF-2可促进神经元的轴突分支和突触发生，在脑缺血损伤后通过增加树突分枝和树突棘密度来促进神经功能的恢复[21]。BDNF在中枢神经系统中含量最丰富、分布最广泛，通过结合和激活受体酪氨酸激酶B(tyrosine receptor kinase B，TrkB)或共受体p75NTR发挥作用，其中BDNF与TrkB受体结合可显著促进由脑缺血诱导的神经再生，尤其是海马SGZ区[22]。BDNF也可通过激活环磷酸腺苷效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)和蛋白激酶PKA来促进神经元成熟和神经发生，越来越多的研究表明，BDNF和磷酸化CREB是调节海马神经发生和改善认知功能的关键因素[23]。VEGF可促进血管生成，血管生成是指从预先存在的血管中分支形成新的微血管，包括内皮细胞的增殖和发芽、管状血管结构的形成、分支和吻合，在脑缺血后4～7 d内发生，主要在缺血核心区和周边交界处，新生血管的生成可使阻塞微血管再通，促进缺血半影区损伤神经元的恢复[24-25]。血管新生和神经发生二者密切相关，缺血后新生血管通过VEGF和laminin/β1-integrin 信号引导轴突发芽，通过一些胞外信号、提供营养物质以及作为迁移支架等促进海马SGZ内源性NSC/NPC增殖，向梗死周围区域迁移和分化为成熟的神经元，从而促进脑缺血后神经重塑和功能性恢复[26]。

3 中药对脑缺血后海马神经发生与修复的干预作用

3.1中药单一有效成分黄芪甲苷(astragaloside VI，AsVI)能够改善脑缺血-再灌注大鼠的学习记忆和运动功能，提高海马DG区BrdU/DCX、BrdU/NeuN和BrdU/GFAP阳性细胞的表达率以及上调海马巢蛋白、p-EGFR和p-MAPK的表达，表明AsVI能够有效激活EGFR/MAPK信号通路从而促进NSC增殖和神经发生[27]。在体外缺氧条件下，川芎嗪能够促进大鼠神经干细胞增殖和向神经元分化，MAPK信号通路参与这一过程，可能与ERK和p38的磷酸化有关[28]。川芎嗪硝酮(tetramethylpyrazine nitrone，TBN)是川芎嗪的合成衍生物，易于穿透血-脑屏障，研究发现，TBN能减轻双侧颈总动脉结扎大鼠海马CA1区神经元损伤和抑制星形胶质细胞激活，通过调节PI3K/Akt/GSK3β通路保护海马神经元免受氧糖剥夺诱导的凋亡，增加轴突萌发及生长，促进轴突的可塑性，此外还能增加脑缺血模型大鼠脑内BDNF的表达，推测增加的BDNF与TrkB结合从而激活PI3K/AKT/GSK3β信号通路[29]。天麻素能够促进脑缺血后海马神经发生，可能与PDE9-cGMP-PKG信号通路有关[30]。淫羊藿苷能够改善双侧颈总动脉结扎诱导的血管性痴呆大鼠的空间学习和记忆能力，抑制海马CA1区神经元丢失，可能与激活海马组织BDNF/TrkB及其下游Akt和ERK/CREB信号通路有关[31]。

3.2中药有效成分配伍梓醇和葛根素制成冻干粉后，能够增加海马DG区BrdU和NeuN阳性细胞的数量，促进小鼠缺血侧海马DG的神经发生[32]。黄芪甲苷、三七总皂苷以及冰片三者配伍后能增加大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型大鼠海马CA1区巢蛋白和NeuN阳性细胞的表达，促进脑缺血-再灌注后神经细胞的增殖、神经元的分化与成熟，且配伍后药物效应增强，显著促进Wnt/β-catenin信号通路的激活，促进细胞增殖和神经发生[33]。

3.3中药复方研究表明，补阳还五汤通过星形胶质细胞缝隙连接蛋白43(connexin 43，Cx43)对海马神经元的树突复杂性以及树突棘可塑性产生影响，表现为海马神经元树突长度、节点数、终末分支数以及树突棘密度大体呈增长趋势，CA1、CA3和DG区以CD31表达量来计算的微血管密度表达水平均升高，从而促进脑缺血-再灌注后修复期的神经元修复和血管再生[34]。升降散能够呈剂量依赖性地促进慢性脑缺血血管性痴呆大鼠海马组织的病理性损伤修复及VEGF和巢蛋白的表达，上调海马组织 Wnt 信号通路关键蛋白 p-LRP，p-GSK3β 和 β-catenin 蛋白水平，促进血管新生和神经干细胞分化，可能与激活Wnt信号通路活性有关[35]。当归芍药散能够增加小鼠脑缺血后海马DG区Ki67、DCX阳性细胞以及BrdU/DCX、BrdU/NeuN和BrdU/GFAP阳性细胞的数量，可能通过增加Akt/GSK3β/β-catenin信号转导来促进脑缺血后海马DG神经发生[36]。参归三圣散提取物能够增强MCAO大鼠感觉运动功能和识别记忆能力，改善脑血流量和梗死面积，促进脑缺血后海马神经发生，可能与调节BMP2/4和Notch1/Hes5信号通路有关[37]。颐脑解郁复方可能通过上调 Notch通路中的Notch1和Hes1基因表达，增加海马DG神经元数量和抑制星形胶质细胞的过度激活，动态调节海马神经发生，对卒中后抑郁大鼠起到治疗作用[38]。

由此，中药可通过抑制星形胶质细胞的过度激活、促进神经元的存活，增加细胞因子如VEGF和BDNF的表达，促进血管新生等来改善脑缺血后海马颗粒下区微环境，从而促进神经干细胞的增殖、迁移、分化等，有利于海马内源性神经发生。然而中药促进脑缺血后海马内源性神经发生涉及的信号通路复杂，单一的中药有效成分可能涉及不同通路，不同的中药有效成分涉及的通路也可能相同，中药配伍以及对应通路间的复杂作用机制需要进一步研究。

以上中药研究情况汇总见表1。

表1 中药调节脑缺血后海马神经发生与修复的作用机制

4 结束语

脑缺血后诱发的机体内源性神经发生是一种代偿性反应，绝大多数增殖后的神经细胞会死亡，故提高脑缺血后新生神经细胞的存活率非常重要。人类海马始终保持产生新生神经元的能力，如果在脑缺血后能够最大程度地激活海马颗粒下区神经干细胞，并提高其增殖后存活的数量，促进海马神经发生，可能对神经功能的修复有很大贡献。中药能够改善脑缺血后的微环境，对海马神经发生与修复起到促进作用，而其中机制复杂，仍需进一步探究。此外，星形胶质细胞能够转分化为神经元，但转化不当会引起神经细胞和胶质细胞的比例失调紊乱，导致神经功能异常，而脑缺血后会引起星形胶质细胞增殖，对神经发生有利有弊，中药能否通过促进营养因子的分泌等促使星形胶质细胞转分化为神经元，并维持这种转化的平衡，以达到促进神经发生的作用，值得进一步研究。另外，在神经发生的不同阶段，用来识别和确定不同特征的亚群细胞的分子标记物繁杂，不同脑区的神经细胞适宜的标记物也有所差别，故在今后的研究中应该慎重选取具有代表性的标记物，或同时采用多个标记物来确定某一特定类型的细胞，以便更好探究中药促进脑缺血后神经发生与修复的作用机制。