青藤碱对脂多糖诱导损伤H9c2大鼠心肌细胞的保护作用

刘月，杨文健，孙晓东，桑明，焦蓉

(湖北医药学院附属襄阳市第一人民医院儿科，襄阳 441000)

脓毒症是一种由感染引起的失控的全身性炎症反应，具有发病率高、死亡率高等特点，是重症监护病房患者死亡的主要原因之一[1-2]。约50%脓毒症患者会出现不同程度的心肌损伤[3-4]，死亡率高达70%[1]。脓毒症心功能障碍的致病因素有多种，其中炎症反应、凋亡和氧化损伤在心肌损伤的发生发展中发挥了重要作用[4]。目前临床上针对脓毒症心功能损伤的治疗措施以改善循环、营养等对症支持治疗为主，仍缺乏特异性治疗方法[4]。因此迫切需要寻找新的治疗脓毒症心肌损伤的药物。青藤碱(sinomenine)是一种吗啡烷类生物碱，主要来源于防己科植物青风藤的根和茎，具有广泛的药理作用，如显著的镇痛、镇静、抗心律失常、抗氧化和抗炎作用[5-7]。青藤碱药用形式多为盐酸盐，临床上广泛应用于治疗风湿病、关节炎、癌症和系膜增生性肾炎等疾病，并且没有明显的不良反应[5，8-10]。研究证实，青藤碱可通过抑制损伤相关分子模式(damage-associated molecular pattern，DAMPs)诱导的“炎症风暴”来改善脂多糖诱导的炎症损伤，发挥重要的抗内毒素和抗炎效应[11]。但是，青藤碱对于脂多糖诱导的心肌损伤研究较少。本实验以H9c2大鼠心肌细胞为研究载体，以脂多糖刺激，比较不同浓度的青藤碱或作用不同时间对心肌细胞的影响，探讨青藤碱对脂多糖诱导损伤的心肌细胞的保护作用。

1 材料与方法

1.1细胞株H9c2大鼠心肌细胞购自中国科学院细胞库(中国上海)，用含10%胎牛血清和1%青/链霉素的高糖达尔伯克必需基本培养液(Dulbecco's minimum essential medium，DMEM)完全培养液培养，置于37 ℃、5%二氧化碳(CO2)培养箱中，饱和湿度下进行常规培养。观察培养液颜色变化和细胞生长状态，及时换液，细胞处于对数生长期时用于实验。

1.2药品与试剂青藤碱(Aladdin公司，批号：S101688，含量≥97%)；脂多糖(美国Sigma公司，批号：L4391，血清型0111：B4)；高糖DMEM培养液(Gibco，批号：8118110)；胎牛血清(四季青公司，批号：20170315)、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸、青链霉素双抗(Gibco，批号：25200056，15240062)；Trizol(MRC公司，批号：TR118)；CCK-8试剂盒(Biosharp公司，批号：BS350A)；兔抗鼠Bax抗体(批号：14796)、兔抗鼠Bcl-2抗体(批号：2764)、兔抗鼠caspase-3抗体(批号：9664)、兔抗鼠caspase-9抗体(批号：9508S)、兔抗鼠丝裂原活化的细胞外信号调节激酶(mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase，MEK)抗体(批号：9154，9126)、兔抗鼠细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)抗体(批号：4370，4695)和兔抗鼠GAPDH抗体(批号：5174)均来自Cell Signaling Technology公司。

1.3细胞处理H9c2大鼠心肌细胞分为正常对照组：细胞培养24 h后，给予无血清的培养基饥饿处理12 h，再更换为完全培养基；脂多糖组：细胞加药前饥饿处理12 h，加入10 μg·mL-1脂多糖，孵育4，8 或12 h；青藤碱组：细胞饥饿处理12 h后分别加入25，50，100 μmol·L-1青藤碱作用30 min，再予以10 μg·mL-1脂多糖孵育4，8或12 h。

1.4细胞活性测定使用CCK-8试剂盒测定细胞活力。取生长状态良好的对数期H9c2细胞，按每孔8000个细胞密度接种于96孔板，每孔100 μL。待细胞生长至每孔面积的85%后，更换为无血清的高糖DMEM培养基，饥饿处理12 h后，向各孔内加入25，50，100，150，200 μmol·L-1青藤碱，重复5个孔，每孔100 μL。同时，部分孔加入完全培养基100 μL作为正常对照组。12 h后，向各孔中加入CCK-8溶液10 μL，并继续孵育，4 h后使用酶标仪检测540 nm处各孔的吸光度(A)值，计算细胞存活率。细胞存活率(%)=(A给药组-A空白)/(A对照组-A空白)×100%。

1.5实时荧光定量-聚合酶链反应(RT-PCR)测定向12孔板各孔中加入 Trizol试剂300 μL，反复吹打后收集上清液，提取各组细胞RNA。使用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit和oligo dT将每组 RNA样品2 μg逆转录为cDNA。按照说明书要求，采用SYBR Green在7500 Real Time PCR System(Applied Biosystems)进行RT-PCR。GAPDH用作参照基因。使用2-△△CT计算肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β、IL-6和单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)的相对mRNA水平。引物序列如下：TNF-α上游：5′-AGCATGATCC GAGATGTGGAA-3′，下游：5′-TAGACAGAAGAGCGTGGTGGC-3′；IL-1β上游：5′-GGGATGATGACGACCTGCTAG-3′，下游：5′-ACCACTT-GTTGGCTTATGTTCTG-3′；IL-6上游：5′-GTTGCCTT CTTGGGACTGATG-3′，下游：5′-ATACTGGTCTGTTGT-GGGTGG T-3′；MCP-1上游：5′-AGTCGGCTGGAGAA-CTACAAGA-3′，下游：5′-CTGAAGTCCTTAGGGTTGAT-GC-3′；GAPDH上游：5′-GACATG CCGCCTGGAGAAAC-3′，下游：5′-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3′。

1.6免疫印迹(Westernblotting)测定提取各组细胞蛋白质：在6孔板内各加蛋白裂解液500 μL，冰上裂解细胞30 min，12 000 r·min-1离心10 min后获得蛋白上清液。使用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白质测定试剂盒测定各组蛋白质浓度。每组样本混匀后取40 μg进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrop-horesis，SDS-PAGE)，然后转移到聚偏二氟乙烯[poly(vinylidene fluoride)，PVDF]膜(Millipore，Billerica，MA，美国)。由TBST配置的5%脱脂奶粉封闭PVDF膜90 min，再用一抗封闭液孵育过夜。次日，用TBST缓冲液洗涤5次后，二抗室温下再孵育1 h，后用TBST清洗5次。配制电化学发光显色液，在暗房中显影。

1.7统计学方法采用SPSS 17.0版软件进行统计学分析。使用T-test和方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1青藤碱对细胞活力影响青藤碱和(或)脂多糖作用H9c2心肌细胞12 h后检测各组细胞的活力(n=5)，正常对照组细胞活性为100%，而25，50，100，150，200 μmol·L-1青藤碱处理12 h后各组细胞活力依次为97.0%，96.5%，94%，93.5%，92.0%，较正常对照组存活率稍有下降，但均差异无统计学意义(均P>0.05)。浓度<200 μmol·L-1的青藤碱对细胞活力的影响较小，差异无统计学意义，可排除青藤碱对细胞活性的影响，不干扰本实验结果。

2.2青藤碱对H9c2心肌细胞炎症因子的影响 脂多糖组H9c2细胞TNF-α、IL-6、IL-1β和MCP-1 mRNA水平均显著高于正常对照组，青藤碱组炎症因子的mRNA水平显著下降，其中100 μmol·L-1青藤碱作用最为显著(P<0.01)。脂多糖作用心肌细胞4 h后，TNF-α、IL-6、IL-1β和MCP-1的mRNA水平即明显升高，并且在12 h内达最高水平，而青藤碱组在12 h内IL-6、IL-1β和MCP-1基因水平均显著低于脂多糖组，见图1。青藤碱呈剂量和时间依赖性抑制脂多糖诱导的心肌炎症因子的基因水平。

A.正常对照组；B.脂多糖组；C.青藤碱25 μmol·L-1组；D.青藤碱50 μmol·L-1组；E.青藤碱100 μmol·L-1组。①与正常对照组比较，t=6.80～19.69，P<0.01；②与脂多糖组比较，t=6.80～30.80，P<0.05；③与脂多糖组比较，t=14.50～38.40，P<0.01。

2.3青藤碱对细胞凋亡的影响见图2。与正常对照组比较，脂多糖不同程度地促进心肌细胞的凋亡，caspase-3和caspase-9蛋白表达量明显升高，Bcl-2/Bax比值显著下降；与脂多糖组比较，青藤碱组caspase-3和caspase-9表达量显著下降，Bcl-2/Bax比值明显升高。其中，与作用0.5 h比较，青藤碱对caspase-3和caspase-9的抑制作用在2 h时效果更为显著。较青藤碱25 μmol·L-1组，青藤碱100 μmol·L-1组H9c2细胞Bcl-2/Bax比值显著升高，心肌细胞凋亡显著改善。

A.正常对照组；B.脂多糖组；C.青藤碱25 μmol·L-1组；D.青藤碱50 μmol·L-1组；E.青藤碱100 μmol·L-1组。①与正常对照组比较，t=5.00～22.05，P<0.01；②与脂多糖组比较，t=10.90～11.85，P<0.01；③与脂多糖组比较，t=7.20，P<0.05。

2.4青藤碱对MEK/ERK1/2通路的影响 见图3。脂多糖组p-ERK和p-MEK表达量与正常对照组比较显著升高，并且脂多糖作用2 h后p-ERK和p-MEK表达量显著高于脂多糖作用0.5 h组，说明脂多糖呈时间依赖性地升高p-ERK和p-MEK蛋白水平。青藤碱组蛋白表达量较脂多糖组显著下降，并且青藤碱处理2 h内磷酸化的ERK和MEK表达量均低于脂多糖组。

A.正常对照组；B.脂多糖组；C.青藤碱100 μmol·L-1组。①与正常对照组比较，t=10.00，41.00，P<0.05；② 与正常对照组比较，t=22.00～71.00，P<0.01；③与脂多糖组比较，t=10.29，18.58，P<0.05；④与脂多糖组比较，t=22.47，24.60，P<0.01。

3 讨论

心功能障碍是脓毒症患者常见的并发症，严重影响患者预后。心功能障碍的发生伴随着过度的炎症反应、线粒体功能障碍和凋亡。脂多糖是公认的一种致病因子，可诱发脓毒症[12]。本研究采用10 μg·mL-1脂多糖刺激H9c2建立心肌损伤模型，脂多糖处理H9c2以后，细胞促炎因子水平显著升高，细胞凋亡增多，提示模型制备成功[13]。

近年来越来越多的研究发现，青藤碱可显著抑制炎症反应，作用机制为：抑制损伤相关分子模式诱导的“炎症风暴”来改善脂多糖诱导炎症损伤[14]；抑制P38丝裂原活化蛋白激酶和核因子-κB信号通路发挥抗炎作用[5]。Caspase-3是caspase信号通路中凋亡的关键执行者。青藤碱可调控caspase的活化以诱导各种细胞凋亡[15]。青藤碱在不同的疾病中对凋亡的作用不同，如在肿瘤的病程中，青藤碱促进癌细胞凋亡，抑制癌症病程[16-17]；在非恶性肿瘤的病程中，青藤碱抑制功能细胞凋亡，减轻组织损伤[15，18-19]。

脂多糖作用后，炎症因子过度表达，心肌细胞凋亡坏死，青藤碱则显著降低细胞促炎症因子水平，并下调caspase-3和caspase-9，抑制细胞凋亡，部分阻断MEK/ERK的活化。MEK/ERK作为丝裂原活化蛋白激酶家族中的重要成员，调控细胞凋亡、增殖和分化。脂多糖与TLR4结合激活下游信号通路，激活MEK/ERK，促进细胞凋亡[20-21]，提示青藤碱可能通过抑制MEK/ERK的活化来抑制凋亡，改善心肌细胞损伤。此外，青藤碱也可通过Nrf2-keap1-PKC通路改善脓毒症小鼠氧化应激损伤[22]；通过烟碱型乙酰胆碱受体(α7nAChR)抑制巨噬细胞中CD14/TLR4的表达，激活JAK2/STAT3通路，抑制机体TNF-α、MCP-1、MIF和MMP-9的表达水平，改善炎症损伤[23]。

本研究的局限性为没有进行动物实验，没有直观观察青藤碱对脓毒症大鼠心功能和生存率的影响。其次，应用H9c2细胞进行实验，而非大鼠原代心肌细胞，这两种细胞在生理特性上仍存在差异。但是，本研究不仅探究了青藤碱的抗炎效果，还探究了不同作用时间及浓度对心肌细胞的作用，为脓毒症心功能障碍的治疗提供新的治疗方向。