饲喂高蛋白日粮对雏鹅血清尿酸水平、肝脏和肾脏超微结构及ABCG2表达的影响

王 志，胡仲皓，桂雪儿，冯士彬，李 玉，王希春，李锦春，吴金节

(安徽农业大学 动物科技学院，安徽 合肥 230036)

尿酸是禽类嘌呤代谢的最终产物[1]。机体中的尿酸水平取决于2个因素，一是尿酸在肝脏中合成的速度。尿酸是嘌呤的代谢产物，尿酸水平受控于机体产生或吸收的嘌呤量；二是尿酸自肾脏排泄的速度[2]。尿酸排泄对血尿酸水平的影响最大，禽类高尿酸血症主要是由于尿酸排泄减少引起的[3]。尿酸生成和/或排泄异常，可导致血清尿酸水平增加，当超过一定值时就形成高尿酸血症[4]。研究证实，高尿酸血症会导致痛风、肾功能异常等疾病的发生发展，对机体健康造成极大的危害[5]。因此，加强高尿酸血症的防治具有重要的理论和实际意义。

尿酸的排泄是一组表达在肾近曲小管上的尿酸盐转运分子协同运作的结果[6]。尿酸排泄障碍的最常见原因是尿酸盐转运体在肾脏的表达异常。目前研究认为，三磷酸腺苷结合盒转运蛋白G2(ABCG2)负责尿酸的排泄，与高尿酸血症和痛风的发生密切相关。相比其他尿酸盐转运体(URAT1和GLUT9)，ABCG2的基因变异种类最多，对血尿酸水平的影响最大[7]。因此，本实验通过饲喂高蛋白造雏鹅高尿酸血症模型，研究雏鹅高尿酸血症对ABCG2表达的影响，为高尿酸血症的治疗和预防提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组及饲粮

实验选用体重(112±1.09) g左右的1日龄雁鹅72只，随机分成对照组(CP)、高蛋白1组(HP1)，高蛋白2组(HP2)，每组24只鹅。基础饲粮参照鹅的营养需要制备，其中粗蛋白质含量为18%。对照组饲喂基础日粮，HP1组粗蛋白质含量为23%的饲粮，HP2组粗蛋白质含量为28%的饲粮，3种饲粮的能量水平一致。3种饲粮组成见表1。试验为期14 d。雏鹅自由采食，充足饮水，按正常免疫程序进行免疫接种。

1.2 样品采集

每组随机选取10只7日龄和14日龄鹅，空腹8 h 后颈静脉采血1～2 mL，室温倾斜静置30 min，3 000 r·min-1离心15 min后分离血清，-20 ℃保存。采取14日龄鹅的肝脏、肾脏、十二指肠、空肠，一部分存于冻存管中，一部分固定于体积分数为10%的福尔马林溶液中，另一部分固定到体积分数为2.5%的戊二醛中，用于日产JEM-1230型透射电镜观察并拍照。

1.3 血液尿酸测定

7日龄和14日龄鹅的血液尿酸浓度用迈瑞BS-220全自动生化分析仪测定。

1.4 主要仪器与试剂

实验所涉及的主要仪器和试剂：全自动生化分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司BS-220，中国)，上海源叶生物科技有限公司ELISA检测试剂盒，ABCG2抗体(Affinity，中国)，RIPA细胞裂解液(Biosharp，中国)，蛋白磷酸酶抑制剂(Solarbio，中国)，BCA蛋白质浓度分析试剂盒(Biosharp，中国)，β-Actin Mouse Monoclonal Antibody(Beyotime，中国)，彩色预染蛋白质分子质量标准(Beyotime，中国)，辣根酶标记山羊抗小鼠Ig G(中山金桥，中国)，电泳仪(EPS300，Tanon，中国)，Rrefrigerated Centrifuge(TGL-18R，Hema，中国)，ChemiDoc成像系统(Bio-Rad，USA)，显微镜(Olympus CX31，日本)，透射电镜(JEM-1230，日本)，Multiskan Mk3微孔板(Thermo Scientific，USA)，RNA浓度分析仪(NanoVue plus，Thermo，USA)，实时定量PCR仪器(Thermo，USA)。

表1 鹅的饲粮营养组成与含量(风干基础)

1.5 实验方法

1.5.1 实时荧光定量PCR

将液氮研磨好的肝、肾、十二指肠、空肠组织放入1 mL Trizol试剂中，加入200 μL氯仿摇匀20次，1 2000×g离心15 min，取500 μL上清液，加入500 μL异丙醇，1 2000×g离心10 min；弃去上清液，加入500 μL 80%乙醇，7 500×g离心5 min，弃去上清液。每个样本取500 ng总RNA进行反向转录。

GoTaqqPCR Master Mix System(Promega)用于测量mRNA表达。每个反应包含互补DNA模板，10 μmol·L-1正向引物(2 μL)，10 μmol·L-1反向引物(2 μL)，2×GoTaqqPCR主混合物(25 μL)和ddH2O(可变)至总体积50 μL。使用以下热循环程序进行定量PCR(qPCR)：95 ℃持续2 min，然后进行40个循环的95 ℃持续15 s和60 ℃持续1 min。在qPCR后，通过在60 ℃下孵育反应30 s，然后以0.2 ℃·s-1的速率将温度从60 ℃升高至95 ℃来进行熔解曲线分析。随后，将反应在20 ℃下温育10 s，在42 ℃下温育15 min，并在85 ℃下温育5 s。使用2-ΔΔCt方法分析相对基因表达水平。用于鹅ABCG2表达的qPCR分析的引物序列如下：ABCG2-F：5′-TAGTGTTGGTCAGAGACAGC-3′；ABCG2-R：5′-GTGCAATGGTCAGAACTGTG-3′，长度为167 bp。

1.5.2 蛋白质印迹

用RIPA细胞裂解缓冲液和蛋白磷酸酶抑制剂从肝、肾、十二指肠、空肠中提取总蛋白(300 mg，每组3只)，使用BCA蛋白质浓度测定试剂盒测定蛋白质浓度，用电泳仪对蛋白质进行电泳。使用以下抗体：抗ABCG2，抗β-肌动蛋白，山羊抗兔IgG。免疫复合物用Western blotting检测试剂盒(Advansta，USA)显示，印迹用ChemiDoc-MP成像系统。用Imageproplus6.0分析谱带密度，并与β-肌动蛋白谱带密度进行归一化。蛋白质相对表达水平与正常对照组的平均水平一致。

1.5.3 免疫组化法学

将肝、肾、空肠和十二指肠组织固定在4%多聚甲醛中，石蜡包埋，切成4 μm厚的切片。ABCG2蛋白表达用抗ABCG2(1∶300)抗体进行免疫组化检测，以山羊抗兔IgG(1∶500)为二抗。免疫标记切片在光学显微镜下观察和成像(CX31，日本奥林巴斯)，免疫染色阳性面积和积分光密度(IOD)用Imageproplus6.0进行测量，从每只鸡的3个切片中随机抽取9张图像进行IOD分析。为了定量分析免疫组化结果，平均光密度计算为：IOD/总区域。

1.6 统计分析

数据用平均值±标准差表示。用SPSS20.0软件进行单因素方差分析，Duncan多重比较，P<0.05具有统计学意义，用GraphPad Prism 8做柱状图进行比较分析。

2 结果与分析

2.1 试验鹅肝脏、肾脏组织电镜观察结果

2.1.1 试验鹅肝脏组织电镜观察结果

利用透射电镜观察试验鹅肝脏细胞结构的变化，结果如图1所示。CP组肝脏细胞器结构完好，HP1、HP2组部分线粒体开始出现肿胀、空泡变性，糖原减少，内质网肿胀消失。

2.1.2 试验鹅肾脏组织电镜观察结果

利用透射电镜观察试验鹅肾脏细胞结构的变化，结果如图2所示。CP组肾脏细胞器结构完好，HP1、HP2组部分线粒体开始出现肿胀、空泡变性，核膜间隙增大。

2.2 7日龄和14日龄雏鹅尿酸水平

如表2所示，雏鹅7日龄时，HP2组鹅的血清尿酸水平极显著高于CP组和HP1组(P<0.01)。雏鹅14日龄时，HP2组鹅的血清尿酸水平极显著高于CP组和HP1组(P<0.01)，HP1组鹅血清尿酸水平极显著高于CP组(P<0.01)。

2.3 鹅ABCG2在肝脏、肾脏、十二指肠、空肠中的相对表达量

qPCR结果如图3所示，HP2组鹅十二指肠中ABCG2的相对表达量极显著(P<0.01)高于CP组和HP1组，空肠中ABCG2的相对表达量极显著(P<0.01)高于CP组和HP1组，肾脏中ABCG2的相对表达量极显著低于CP组和HP1组(P<0.01)。HP1组鹅肾脏ABCG2的相对表达量显著低于CP组(P<0.05)，空肠ABCG2的相对表达量显著高于CP组(P<0.05)。各处理组的ABCG2相对表达量在肝脏中无明显差异(P>0.05)。

放大倍数20 000×。A，CP组；B，HP1组；C，HP2组。下同。The magnification was 20 000 times the original size. A，Group CP; B，Group HP1; C，Group HP2. The same as below.图1 各组鹅肝脏细胞电镜图片Fig.1 Transmission electron microscopic pictures of liver cells of goslings in each group

图2 各组鹅肾脏细胞电镜图片Fig.2 Transmission electron microscopic pictures of kidney cells of goslings in each group

表2 7日龄和14日龄雏鹅血清尿酸值

2.4 鹅肝脏、肾脏、十二指肠、空肠中ABCG2蛋白表达水平

蛋白质印记(Western-blotting)结果如图4所示，HP2组鹅十二指肠、空肠ABCG2的相对表达量显著(P<0.05)高于HP1组，极显著高于CP组(P<0.01)，鹅肾脏ABCG2的相对表达量极显著低于CP组和HP1组(P<0.05或P<0.01)；HP1组鹅空肠、十二指肠ABCG2蛋白的相对表达量显著高于CP组(P<0.05)。HP1组鹅肾脏ABCG2蛋白的相对表达量显著低于CP组(P<0.05)。实验组与对照组的ABCG2表达强度在肝脏中无明显差异(P>0.05)。

同一组织不同处理间没有相同小写字母表示差异显著(P<0.05)，没有相同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。下同。The bars without the same lowercase or uppercase letters within the same organ showed significant difference at the level of 0.05 or 0.01，respectively. The same as below.图3 鹅肝脏、肾脏、十二指肠、空肠中ABCG2-mRNA相对表达量Fig.3 Relative expression level of ABCG2-mRNA in liver，kidney，duodenum and jejunum of goslings

图4 鹅肝脏、肾脏、十二指肠、空肠中ABCG2蛋白表达量Fig.4 ABCG2 expression in liver，kidney，duodenum and jejunum of goslings

2.5 鹅肝脏、肾脏、十二指肠、空肠中ABCG2蛋白水平

免疫组化结果如图5显示，ABCG2蛋白在肝细胞、肾顶膜、肠平滑肌和肠绒毛中均有分布。HP2组鹅十二指肠中ABCG2的表达水平极显著(P<0.01)高于CP组和HP1组，空肠中ABCG2的表达水平极显著(P<0.01)高于CP组，显著(P<0.05)HP1组，肾脏中ABCG2的表达水平和HP1组，极显著低于CP组(P<0.01)。HP1组鹅十二指肠中ABCG2的表达水平极显著(P<0.01)高于CP组，空肠中ABCG2的表达水平显著(P<0.05)高于CP组，而肾脏ABCG2的表达水平显著低于CP组(P<0.05)。CP、HP1和HP2组的ABCG2表达强度在肝脏中无明显差异(P>0.05)。

图5 鹅肝脏、肾脏、十二指肠、空肠中ABCG2蛋白表达量Fig.5 ABCG2 protein expression in liver，kidney，duodenum and jejunum of goslings

3 讨论

肝脏和肾脏的超微结构变化分析，高蛋白日粮可引起雏鹅肝脏和肾脏细胞器损伤，尤其是对肾脏的损伤[8-9]。肾脏是尿酸的主要排泄器官，肾脏损伤使尿酸排泄量降低，这也可能是高蛋白日粮诱发高尿酸血症的主要原因之一。

已有文献证实，饲喂高蛋白饲料会导致高尿酸血症的发生[10-12]。尿酸在肝脏中合成，通过肾脏迅速排出体外，使血液中的尿酸浓度维持恒定[13]，但是当机体生成尿酸过多，超过肾脏的排泄能力，将不可避免地发生高尿酸血症[14]。本实验结果证实，饲喂雏鹅高蛋白日粮导致雏鹅尿酸排泄增加，血液尿酸水平升高。本实验饲喂高蛋白日粮成功构建了雏鹅高尿酸血症模型。

ABCG2是ATP结合盒转运蛋白家族G成员2[15]。ABCG2作为一种高容量的尿酸盐转运蛋白，可介导体内尿酸排泄，当其发生基因突变时可影响高尿酸血症和痛风的发生发展[16]，其功能异常可导致尿酸排泄能力下降[17]。研究表明，ABCG2对于尿酸排泄具有重要作用，在研究高尿酸血症和痛风的发病机制中至关重要[18-20]。体内尿酸主要通过肾脏排出体外，其次是通过肠道排出，从胆管排出的尿酸占所有排泄物的5%[21]。本研究结果表明，ABCG2在雏鹅肝脏、肾脏、空肠和十二指肠等器官均有表达，提示尿酸的肾肠排泄和胆汁排泄。饲喂高蛋白日粮诱导的高尿酸血症雏鹅肝脏ABCG2表达水平无明显变化，空肠和十二指肠中ABCG2表达水平上调，而肾脏中ABCG2表达水平下调，提示尿酸肾排泄减少而肠排泄增加。有报道称rs223114和rs72552713介导的ABCG2突变可影响肠道尿酸排泄[22-24]，肠ABCG2在肾功能异常所致的肾尿酸转运功能下降时可起到补偿作用[25]。据此推测，持续饲喂高蛋白日粮引起ABCG2的过度表达可能是由于肾功能异常导致尿酸肾排泄减少肠排泄增加的一种代偿机制。然而，这一机制还需要进一步研究证实。

综上所述，饲喂高蛋白日粮导致雏鹅肝脏、肾脏细胞受损，体内尿酸水平升高，引发雏鹅高尿酸血症，空肠、十二指肠ABCG2的表达增加，而肾脏ABCG2的表达降低。