基于重组截短蛋白mp-tGAPDH的微小支原体抗体间接ELISA检测方法建立和应用

付 媛，石团员，孙洪超

(浙江省农业科学院 畜牧兽医研究所，浙江 杭州 310021)

嗜血支原体(Hemotropicmycoplasma，HM)，又称附红细胞体，是一类感染多种哺乳动物，寄生于红细胞表面及骨髓中的支原体[1]。HM破坏红细胞导致宿主发生溶血性、传染性贫血，可导致母猪流产死胎、仔猪贫血、黄疸和消瘦[2-3]。我国猪群中流行三种HM，早期鉴定的猪支原体(Mycoplasmasuis，M.suis猪附红细胞体)、2011年分子生物学水平鉴别的微小支原体(M.parvum)和2017年报道的新种CandidateMycoplasmahemosuis(CMh)[4-6]。

PCR方法病原流行病学调查发现M.parvum在我国浙江和海南有较高的流行率，两种或三种猪源HM混合感染多有发生，母猪感染率较高[6-7]，目前仅有M.suis血清抗体检测方法的报道[8-9]，缺少M.parvum和CMh的抗体检测方法。甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GAPDH)是糖酵解途径中重要的酶类和看家基因，同时具有参与细胞内消化、tRNA转运、DNA修复和复制、细胞凋亡等多种生物学功能[10]。研究表明，M.suis的GAPDH(以前称作MSG1)也同样有重要的生理功能，作为和红细胞膜黏附相关的黏附因子对于猪附红体的生物化学反应和生理功能有重要的意义，也是致病相关因子，同时该蛋白具有良好的免疫原性，可用于血清学诊断[11]。我们已克隆到M.parvumZJ9330株GAPDH基因序列mp-gapA[12]。在前期研究的基础上，本研究拟建立M.parvum血清抗体 ELISA方法，用于检测猪群M.parvum抗体水平和流行病学监测，为该病的控制提供基本资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、载体和血清

大肠埃希菌Transetta(DE3)感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司，由248份血液采自浙江省绍兴上虞、杭州萧山等6个猪场，实验室分离血清-20 ℃保存备用。M.parvum51份阴性血清为进口种猪血清，由浙江省出入境检验检疫局检验检疫技术中心惠赠，经PCR检测病原阴性。M.parvum阳性血清为PCR方法鉴定阳性母猪采集血清，小鼠抗mp-tGAPDH血清由本试验室制备保存。M.parvumDNA模板、pET28载体、M.suis和CMh阳性血清、猪弓形虫病(Toxoplasmagondii，TG)的阳性血清均由本试验室保存。猪圆环病毒病(porcine circovirus，PCV)、猪瘟(classical swine fever virus，CSFV)、伪狂犬病(pseudorabies virus，PRV)、猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)阳性血清均来自IDEXX 公司相应的ELISA检测试剂盒。

1.1.2 主要试剂和仪器

过氧化物酶标山羊抗猪IgG购自KPL公司；亲和层析Ni-NTA Argrose Beads为Invitrogen公司产品，TMB和其他试剂购自上海生工生物工程技术服务有限公司；酶标仪为美国Molecular Devices公司Spectra Max M5；蛋白电泳仪为Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 抗原制备

根据已克隆M.parvum浙江9330株的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因gapA序列信息(序列号KU246052)[12]，比对已知的3种猪源HMgapA基因序列分析，选择差异较大且抗原性好的区域设计引物，序列为mpgnf：5′-ccatggGCAGAAATTTATTAGA-3′;mpgnr：5′-ctcgagAACAATTAAATTATGG-3′，上游引物含有NcoⅠ(ccatgg)酶切位点和保护性碱基，下游引物含有XhoⅠ(ctcgag)酶切位点，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，预期扩增404 bp片段。扩增截短蛋白mp-tGAPDH DNA序列，构建pET28-mp-tGAPDH质粒，在大肠埃希菌Transetta(DE3)优化表达mp-tGAPDH，通过Ni Argrose纯化蛋白，用小鼠抗mp-tGAPDH血清Western-blot检测其抗原性。

1.2.2 最佳包被浓度及血清最佳稀释倍数的确定

采用方阵滴定的方法，将起始浓度为560 μg·mL-1mp-tGAPDH纯化蛋白用pH 9.6的碳酸盐缓冲液倍比稀释包被酶标板，每孔100 μL，每个浓度包被1行，37 ℃温育1 h后，4 ℃过夜，取出用PBST洗涤液洗涤3次，每次3 min，每孔加入200 μL 5%脱脂乳封闭液，37 ℃封闭1 h，PBST洗涤；阳性血清和阴性血清分别在酶标板的前6列及后6列进行横向倍比稀释，每个稀释度纵向做8孔重复，每孔100 μL，37 ℃反应1 h后，PBST洗涤；加入1∶10 000羊抗猪IgG-HRP(用封闭液稀释)，每孔100 μL，37 ℃反应30 min；洗涤后加入TMB底物100 μL，室温反应5 min；最后加入50 μL 0.5 mol·L-1H2SO4终止反应，用酶标仪在450 nm波长下测定D值，以阳性血清作用孔D450值开始出现较大变化，而对应的阴性血清孔D450值基本不变所对应的抗原浓度及血清稀释倍数作为抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释倍数。

1.2.3 最佳封闭液和封闭时间选择

分别以最适mp-tGAPDH抗原浓度37 ℃1 h，4 ℃过夜包被酶标板，洗涤3次后，用质量百分数为2.5%、5.0%、7.5%的脱脂奶粉，1%、2%、3%BSA等6种不同的封闭液进行封闭，每孔150 μL于37 ℃封闭0.5、1.0和1.5 h。分别按照间接ELISA检测程序操作，测定D450，计算各组阴、阳性血清的P/N值，选择合适的封闭液和封闭时间。

1.2.4 血清最佳反应时间

按照最佳条件依次包被、封闭和加入血清，37 ℃下反应0.5、1.0和1.5 h，重复2孔。后进行ELISA检测，测定D450，计算各组阴、阳性血清的P/N值，以选择合适的血清最佳反应时间。

1.2.5 酶标二抗工作浓度和时间的确定

按照最佳条件依次包被、封闭和加入血清作用后，经洗涤加入酶标二抗(1∶7 500、1∶10 000、1∶12 500稀释)，每孔100 μL，重复2孔，37 ℃下反应30、45、60 min，进行ELISA检测，测定D450，计算各组阴、阳性血清的P/N值，以选择适宜酶标二抗工作浓度和时间。

1.2.6 间接ELISA阳性临界值的确定

1.2.7 特异性试验

用建立优化好的mp-tGAPDH间接ELISA方法分别检测几种常见猪病PCV、CSFV、PRV、PRRS、TG的阳性血清，酶标仪读取D450值，以此确定ELISA方法检测血清的特异性。

1.2.8 重复性试验

1.2.9 ELISA检测猪源嗜血支原体抗体应用

用mp-tGAPDH ELISA方法对浙江上虞地区5个不同猪场的248份送检血清进行抗体检测，分别统计M.parvum阴、阳性血清份数。

2 结果与分析

2.1 抗原表达

PCR扩增mp-tGAPDH DNA序列连接pET28a载体，将重组质粒进行测序鉴定为404 bp，与预期相符，编码134个氨基酸(图1)。将构建好的pET28-mp-tGAPDH表达的截短蛋白转化大肠埃希菌Transetta(DE3)后，IPTG诱导重组蛋白的表达，经SDS-PAGE电泳可以观察到，mp-tGAPDH在大肠埃希菌Transetta(DE3)中大量表达，相对分子质量约为15 ku，与预期相符(图2)。Western-blot表明，纯化蛋白mp-tGAPDH与小鼠抗mp-tGAPDH血清有较好的反应性(图3)。

2.2 最佳包被浓度及血清最佳稀释倍数的确定

mp-tGAPDH重组蛋白方阵滴定试验结果表明，纯化抗原在1∶10～1∶160稀释度时与阳性血清反应的D450值变化较小，而在1∶160～1∶1 280稀释度时与阳性血清反应的D450值大幅度下降，因此选定D450值开始出现大幅度降低时的抗原稀释倍数1∶160(560/160，3.5 μg·mL-1)包被。抗原在1∶160稀释时，1∶160稀释的阳性血清与阴性血清的比值(P/N)最大，此时阳性血清D450值接近于1，阴性血清的D450值基本不变，因此，选择1∶160为血清最佳稀释倍数。

M，DNA marker DL1000；1、2，M. parvum阳性血液PCR扩增mp-tGAPDH 基因片段；3、4，阴性对照；M, DNA marker DL1000; 1, 2, PCR product of mp-tGAPDH from M. parvum positive blood sample; 3, 4, Negative control.图1 mp-tGAPDH基因PCR扩增Fig.1 Amplified mp-tGAPDH gene fragment by PCR

M，Protein marker；Lane 1, 2，pET28-mp-tGAPDH在大肠埃希菌Transetta(DE3)表达目的片段的SDS-PAGE电泳；3，pET28a 在大肠埃希菌Transetta(DE3)表达目的片段的SDS-PAGE分析。M, Protein marker; Lane 1, 2, pET28-mp-tGAPDH in Transetta(DE3); 3, pET28a in Transetta(DE3).图2 mp-tGAPDH在大肠埃希菌中的表达分析Fig.2 SDS PAGE analysis expression of mp-tGAPDH in different E. coli

M，Protein marker；1，纯化mp-tGAPDH的SDS-PAGE电泳分析；2，小鼠抗mp-tGAPDH 血清和mp-tGAPDH纯化蛋白的Western-blot反应，箭头指示反应条带。M, Protein marker; 1, SDS-PAGE of purified mp-tGAPDH; 2, mp-tGAPDH Western-blot using mouse anti-mp-tGAPDH serum. Reaction band indicated by arrow.图3 重组蛋白mp-tGAPDH Western-blot分析免疫反应性Fig.3 Western-blot analysis immunoreactivity of mp-tGAPDH

2.3 最佳封闭液和封闭时间选择

将包被好的ELISA 酶标板条分别以 2.5%、5.0%、7.5%脱脂乳，1%，2%、3%BSA进行封闭，随机选取的6份M.parvum阳性血清(P)和6份阴性血清(N)用ELISA方法测定D450值之比(P/N)。从P/N值可以看出，7.5%脱脂奶粉最佳，其次为5.0%脱脂奶粉，而BSA作为封闭液阴性本底高，不适宜封闭(表1)。

将包被好的ELISA 酶标板条分别选用5.0%和7.5%脱脂奶粉封闭0.5、1.0、1.5h后，随机选取的6份M.parvum阴、阳性血清所测定的D450值之比(P/N)如表2所示，mp-tGAPDH抗原以5%脱脂奶粉封闭1.5 h结果最理想。

表1 mp-tGAPDH ELISA最佳封闭液优化结果

表2 mp-tGAPDH ELISA封闭液封闭时间优化结果

2.4 血清最佳反应时间

在确定的重组抗原最佳包被浓度、血清最佳稀释倍数、最佳封闭液浓度、最佳封闭时间的条件下，随机选取的6份M.parvum阴、阳性血清作用时间设置3个梯度，所测定的D450值之比。血清作用0.5、1.0、1.5 h后，从测定血清的P/N值看，mp-tGAPDH重组抗原ELISA方法待检血清作用1.0 h效果最佳(表3)。

2.5 酶标二抗工作浓度和时间的确定

采用优化好的其他ELISA条件，选用1∶7 500、1∶10 000、1∶12 500稀释的二抗作用30 min后，测定随机选取的6份M.parvum阳(P)、阴(N)性血清D450比值(P/N)。测定的结果表明，mp-tGAPDH抗原包被的板以二抗1∶12 500稀释浓度作用最佳(表4)。

采用优化好的其他ELISA条件，选用1∶12 500稀释的二抗作用30、45、60 min后，测定随机选取的6份M.parvum阳、阴性血清的D450P/N值。测定的结果以60 min作用时间最佳(表5)。

2.6 优化后的ELISA反应条件

表3 mp-tGAPDH ELISA血清作用时间优化结果

表4 mp-tGAPDH ELISA二抗稀释倍数优化结果

表5 mp-tGAPDH ELISA二抗作用时间优化结果

经优化mp-tGAPDH间接ELISA操作步骤如下：mp-tGAPDH抗原按3.5 μg·mL-1(1∶160)稀释包被，每孔100 μL，于37 ℃温育1 h后放置于4 ℃过夜；取出用洗涤液洗涤3次，每次3 min，然后每孔加入150 μL 5%脱脂乳，37 ℃封闭1.5 h，洗涤1次；然后将待检血清1∶160稀释后加入酶标板，每孔100 μL，于37 ℃反应1 h；洗涤3次后，加入1∶12 500羊抗猪IgG-HRP(用封闭液稀释)，每孔100 μL，37 ℃反应1 h；经洗涤后加入TMB底物100 μL，室温反应5 min，最后加入50 μL 0.5 mol·L-1H2SO4终止反应，用酶标仪在450 nm波长下测定D值。

2.7 间接ELISA阳性临界值的确定

2.8 特异性试验

用建立的mp-tGAPDH ELISA方法分别检测PCV、CSFV、PRV、PRRS、TG的标准阳性血清，检测结果见表6。mp-tGAPDH间接ELISA与检测的猪病血清无交叉反应，mp-tGAPDH ELISA可以检出CMh阳性血清，不能检出M.suis阳性血清。

表6 mp-tGAPDH 间接ELISA方法的特异性

2.9 重复性试验

2.9.1 批内重复

2.9.2 批间重复

2.10 ELISA检测猪源嗜血支原体抗体应用

用建立的重组抗原ELISA方法对浙江省上虞地区5个猪场248份临床送检血清进行了检测，结果表明M.parvum血清阳性率为36.69% (91/248)，疑似31份。

表7 mp-tGAPDH间接ELISA同批抗原包被板批内变异系数

表8 mp-tGAPDH间接ELISA不同批抗原包被板批间变异系数

3 讨论

嗜血支原体不能体外培养，相关研究进展缓慢，Hoelzle等[11]证实M.suis首个黏附蛋白MSG1具有甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)活性，该蛋白可利用宿主血糖，使宿主血糖浓度急剧下降，重组表达MSG1定位于大肠埃希菌细胞表面，且与猪红细胞膜相互作用，粘附于红细胞表面。同时该重组蛋白作为疫苗候选分子可以引起猪群明显的体液和细胞免疫反应[9]，但攻毒保护试验没有效果，用该重组蛋白建立的ELISA方法有较好的特异性，比菌体抗原ELISA更为敏感和有效[13]。这些研究表明，GAPDH蛋白在猪源嗜血支原体中具有研究价值和意义。

分析三种猪源嗜血支原体GAPDH氨基酸序列发现在20～155 aa区域差异较大，该区域具有良好的抗原性[12]，所以本研究选择表达该段区域截短GAPDH蛋白，为建立ELISA方法提供诊断抗原，并尝试鉴别猪源HMs抗体，但由于GAPDH为看家基因，其保守性不容忽视，建立的ELISA检测方法不能有效的鉴别诊断猪源嗜血支原体抗体。

ELISA方法具有灵敏、快速、简便和易于标准化等优点，本研究首次建立了基于GAPDH截短蛋白mp-tGAPDH的M.parvum抗体检测ELISA方法，与检测的部分猪病血清无交叉反应，具有良好的特异性和重复性，该法为M.parvum临床诊断、流行病学研究和免疫检测提供有效的手段。