护肝利湿膏的稳定性研究

吴声振 邬素珍* 吴向维 邓丽嫦

（佛山市禅城区中心医院，广东 佛山 528000）

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是临床最常见的慢性肝病，会明显增加心脑血管疾病患者的发病率及死亡风险。据统计，在我国东部发达地区，该病的发病率约为15%[1]。由于广东气候高温、高湿，且人们喜食甜食，故NAFLD患者较多。针对该类疾病，中医专家结合多年的临床经验摸索出护肝利湿方剂，临床疗效显著。该方剂由白芍、黄柏、茯苓、薏苡仁、山楂、柴胡等药材组成，具有健脾燥湿、疏肝降脂的功效。护肝利湿方原以汤剂给药为主，但考虑到患者煎煮、携带不便，为此将其改良为内服膏方（煎膏剂）。本文旨在考察护肝利湿膏储存期间的质量变化，探讨药物在贮存过程中的影响因素，为中药膏方的有效期制订提供理论依据[2-5]，并为该方剂进一步研制成中成药提供基础。本研究参考《中华人民共和国药典》2020版“原料药与制剂稳定性试验指导原则”及通则0183煎膏剂项下检查指标[6]，选用护肝利湿膏分别进行影响因素试验、加速试验和长期试验。

1 仪器与试药

1.1 仪器 LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津公司）；BT25S型电子天平（北京赛多利斯仪器有限公司）；微压中药煎煮机（北京东华原医疗设备有限公司）；KQ2200E型超声清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（GZX-9023型，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）；综合药品稳定性试验箱（上海迈杰试验设备有限公司）；DHP9052型电热恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）。

1.2 试药 芍药苷与对照品，批号110736-201842，盐酸小檗碱对照品，批号120823-201802，均来自中国食品药品检定研究院；水为重蒸水，其他试剂均为色谱纯。护肝利湿膏组方中的白芍、黄柏、白术、佛手、山药、薏米、茯苓、柴胡等中药饮片来自广州至信药业股份有限公司，药材经过佛山市食品药品检验检测中心钟然主任药师鉴定为正品。

1.3 方法

1.3.1 相对密度 按《中华人民共和国药典》2020版通则（下简称通则）0601项[6]下的相关规定进行相对密度检查，取3批供试品，每批3瓶，进行相对密度测定。

1.3.2 微生物限度 按照非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法（通则1105）和控制菌检查（通则1106）及非无菌药品微生物限度标准（通则1107）检查[6]。1 g供试品中，细菌数不得超过100 cfu，霉菌、酵母菌数不得超过100 cfu，不得检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌。

1.3.3 含量测定

1.3.3.1 色谱条件 色谱柱Amethyst C18-H（4.6 mm×200 mm，5 μm）；检测波长230 nm；流速1.0 mL/min；流动相乙腈-0.1%磷酸溶液（每100mL加十二烷基磺酸钠0.1 g）（14∶86）；进样量10 μL。

1.3.3.2 护肝利湿膏的制备 根据护肝利湿膏处方组成称取白芍、黄柏、白术、佛手、山药、薏米、茯苓、柴胡等中药饮片，浸泡2 h后，加水煎煮3次，第1次加入药材量8倍的水，煎煮60 min，第2、3次加入药材量6倍的水，每次煎煮40 min。所得药液经滤过、浓缩、收膏等步骤，得到护肝利湿膏样品3批（佛山市禅城区中心医院制备），批号分别为20190101、20190102、20190103。

1.3.3.3 溶液制备 混合对照品溶液的制备：分别称取芍药苷、盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成含芍药苷1.504 mg/mL，盐酸小檗碱1.023 mg/mL的混合对照品储备液。供试品溶液的制备：取护肝利湿膏1 g，加入甲醇50 mL，精密称定，超声处理30 min，放冷，补足损失甲醇，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

1.3.3.4 方法学考察 专属性试验：按护肝利湿膏的药材比例与制备工艺，采用相同的方法制成不含白芍与黄柏的双阴性样品，精密吸取混合对照品、供试品及阴性样品溶液各10 μL，按1.3.3.1项下色谱条件进样。结果表明，阴性样品溶液无干扰，方法专属性良好。见图1。

图1 混合对照品（A）与供试品（B）及双阴性对照（C）

2 结果

2.1 线性关系考察 精密吸取1.3.3.2项下混合对照品溶液，加甲醇稀释为5个不同质量浓度的混合对照品溶液，按1.3.3.1项方法进行检测，平行测定3次，得峰面积平均值，以进样量（μg）为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，得到回归方程分别如下：芍药苷，Y=3455.6X+1486.5（r=0.9991），在0.60～15.042 μg内线性关系良好；盐酸小檗碱，Y=6053.2X+121.76，在0.41～3.07 μg内线性关系良好。

2.2 精密度试验 精密吸取同一混合对照品溶液，按照1.3.3.1项下色谱条件连续进样6次，测定峰面积，并计算各峰面积的RSD，结果显示芍药苷、盐酸小檗碱的峰面积RSD分别为0.42%、0.70%，表明仪器精密度良好。

2.3 稳定性试验 取同一批样品，按1.3.3.2项下方法制备供试品溶液，分别于制备后0、2、4、6、8、12 h，按照1.3.3.1项下色谱条件进样分析，测定并记录峰面积。结果显示芍药苷、盐酸小檗碱的峰面积RSD分别为1.92%、1.43%，表明供试品溶液在12 h内基本稳定。

2.4 重复性试验 取同一批样品，按1.3.3.2项下方法制备6份供试品溶液，按照1.3.3.1项下色谱条件测定，记录峰面积，并计算含量。结果显示芍药苷、盐酸小檗碱的平均含量分别为0.99%、0.17%，RSD分别为1.57%、1.55%。

2.5 加样回收试验 取同一批样品各0.5 g，分别加入已知含量的混合对照品，按1.3.1.2项下方法制备6份供试品溶液，按1.3.3.1项下色谱条件测定，记录峰面积，并计算各峰面积的RSD。结果显示，芍药苷、盐酸小檗碱的平均加样回收率分别为100.01%、99.7%，RSD分别为3.84%、2.38%，表明该方法回收率良好。见表1。

表1 加样回收试验结果（n=6）

2.6 稳定性研究

2.6.1 影响因素试验 取护肝利湿膏样品（批号20190101），分装置合适的洁净容器中，分装为9瓶，随机平均分为高温、高湿和强光照组（每组3瓶），放置10 d，其中高温组条件为温度40 ℃，相对湿度60%±5%；高湿组条件为温度25 ℃，相对湿度90%±5%；强光照组条件为温度25 ℃，照度4500 lx±500 lx。分别于第0、5、10 d取样，以性状、相对密度、含量为指标进行考察。结果显示，样品在高温组放置5 d后表面变得粗糙，质地变硬，相对密度无法测得，在高湿、强光条件下性状无明显变化，相对密度基本一致；样品中芍药苷、小檗碱含量在10 d内基本不变。见表2。

表2 影响因素试验结果

2.6.2 加速试验 取护肝利湿膏3批（批号20190101、20190102、20190103）置稳定性试验箱（温度40 ℃±2 ℃，湿度75%±5%）放置6个月。在试验期间第1、2、3、6个月月末分别取样1次，以性状、相对密度、微生物限度、含量为指标进行考察。结果表明，样品的性状、相对密度、芍药苷、小檗碱含量基本一致，微生物限度符合要求。见表3。

表3 加速试验结果

2.6.3 长期试验 取护肝利湿膏3批（批号20190101、20190102、20190103），在温度（25 ℃±2 ℃）、相对湿度（60%±10%）的条件下放置12个月。分别于第1、3、6、9、12个月月末取样，以性状、相对密度、微生物限度、含量为指标进行考察。结果显示，样品在6个月内各项指标稳定，第9个月芍药苷含量开始明显下降。见表4。

表4 长期试验结果

3 讨 论

中医认为，NAFLD患者可分为肝郁脾虚、痰浊内阻、湿热蕴结、痰瘀互结4种证型，多为肝、脾、肾长期失调所致[7-9]。中药煎膏剂相对汤剂更适合NAFLD患者长期服用治疗。由于药品在贮存期间的质量极有可能受到环境影响而发生变化，因此需对其稳定性进行考察。影响因素试验研究结果表明，护肝利湿膏在高温条件下质地变硬，流动性下降，因此其应在阴凉处密闭保存。加速试验结果表明，样品的性状、相对密度、微生物限度检查、含量测定等项目指标稳定，均无明显变化，说明其质量稳定可靠，包装完好。长期试验6个月内各项指标稳定，在第9个月芍药苷含量开始出现明显下降，故停止实验。实验结果表明，护肝利湿膏的有效期为6个月。

中药煎膏剂的保质期一般为6个月以上，但亦与其制作工艺及处方药物的组成有关[10-14]。考虑到脾虚者不宜多进食肥甘厚味之品，同时为了提高处方含药量，护肝利湿膏由健脾利湿、护肝消脂的中药饮片制作而成，处方中没有胶类药物，2%蜂蜜仅用于改善其口感，远远低于一般煎膏剂30%～50%的水平[15-16]。为保证其流动性，相对密度较一般膏方小，导致表面渗透压浓度相对偏低，可能是降低其稳定性的主要原因，导致其保存期限短于其他煎膏剂。

综上所述，护肝利湿膏在室温、密闭情况下的稳定性较好，有效期建议为6个月。