基于网络药理学和分子对接的五味子甲素、五味子乙素抗癌机制研究

温晓雅，刘 龙，王博龙

(宜春学院 化学与生物工程学院，江西 宜春 336000)

五味子为木兰科植物五味子(Schisandrachinensis(Turcz.) Baill.)的干燥成熟果实，主要含有木脂素、挥发油、多糖、有机酸、鞣质等化学成分，具有保肝护肝、镇静催眠、抗病毒、抗癌及抗炎等药理作用[1].五味子甲素(schizandrin A)、五味子乙素(schizandrin B)是五味子木脂素的核心成分，近年来有关五味子甲素、五味子乙素抗癌的实验报道越来越多，如五味子甲素可以抑制人卵巢癌[2]、胰腺癌[3]细胞的增殖，诱导其凋亡；五味子乙素具有多种机制的抗癌活性[4]，有利于胃癌[5]、肺癌[6]、胆管癌[7]等癌症的治疗.由此可见，五味子甲素、五味子乙素是极具潜力的抗癌活性成分，全面、系统地揭示它们的作用机制，对于五味子抗癌功效的开发利用具有重要意义.

网络药理学与分子对接技术依托生物信息学、高通量组学及计算机科学等多学科融合，通过构建成分-靶点网络，揭示靶点间的协同作用及生物学意义，以及模拟成分与靶点的相互作用，在多成分、多靶点、多通路的中医药复杂研究领域应用广泛[8].本研究运用网络药理学与分子对接技术，解析五味子甲素、五味子乙素的抗癌靶点、生物过程、信号通路等，从生物网络角度探讨五味子甲素、五味子乙素抗癌的潜在机制.

1 研究方法

1.1 五味子甲素、五味子乙素抗癌靶点网络构建

首先在TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)数据库中以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、类药性(drug-likeness，DL)≥0.18%为筛选条件检索五味子甲素、五味子乙素靶蛋白，然后运用UniPort(https://www.uniprot.org/)数据库将上述靶蛋白转换成对应的基因名称；在PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中检索五味子甲素、五味子乙素相对应的Canonical SMILES格式，然后导入SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetp rediction.ch/)数据库，以该平台药效团模型和基于配体分子相似性搜寻方法查找靶基因；又选取CTD(http://ctdbase.org/)数据库中与五味子甲素、五味子乙素相互作用的前1 000个靶点，将以上来源靶点合并去重后得到五味子甲素、五味子乙素潜在靶点.在GeneCards(https://www.genecar ds.org/)、OpenTargets(https://www.Target-validation.org)数据库中以“cancer”为关键词进行检索，将两个数据库获得的靶点合并去重后得到癌症相关靶点.最后将癌症靶点与五味子甲素、五味子乙素靶点输入Venny2.1.0(https://bioinfogpcnb.csic.es/tools/venny/index.html)，取三者交集作为五味子甲素、五味子乙素抗癌潜在靶点.将上述成分及靶点导入Cytoscape3.6.1软件，构建五味子甲素、五味子乙素-抗癌靶点网络图，以节点的连结度(degree)表示五味子甲素、五味子乙素对应的靶点个数，分析五味子甲素、五味子乙素多靶点治疗癌症的药理机制.

1.2 五味子甲素、五味子乙素抗癌靶点相互作用网络构建

将五味子甲素、五味子乙素抗癌靶点导入STRING(https://string-db.org/)平台构建蛋白-蛋白相互作用网络(protein-protein interaction，PPI)，选择物种为“Homo sapiens”，设置medium confidence=0.4，其余参数选择默认值，并将结果保存为TSV格式.将文件信息导入Cytoscape3.6.1软件，利用“Network Analysis”功能进行拓扑参数分析，选取各节点连接度(degree)、介度(betweenness)、紧密度(closeness)同时在平均值之上的靶点作为五味子甲素、五味子乙素抗癌的关键靶点.

1.3 五味子甲素、五味子乙素抗癌靶点的GO功能和KEGG通路富集分析

将五味子甲素、五味子乙素抗癌靶点输入OmicShare(http://omicshare.com/)和DAVID平台(https://david.ncifcrf.gov/)进行GO生物过程与KEGG信号通路分析，然后通过Omicshare 软件对分析结果进行可视化，研究靶点投射的生物过程与KEGG信号通路和癌症之间的关系，明确其治疗癌症的主要药理机制.

1.4 分子对接验证

利用PDB数据库(http://www.rcsb.org/)搜索靶点的蛋白结构，然后应用PyMOL软件对靶点进行去水、去磷酸根等处理.同时利用AutoDuck Tools软件对受体进行加氢、加电荷等操作，输出为可识别的Pdbqt格式.处理后应用AutoDuck Vina软件对靶蛋白与五味子甲素、五味子乙素进行对接.

2 结果与分析

2.1 五味子甲素、五味子乙素-抗癌靶点网络

检索合并TCMSP、Swiss TargetPrediction及CTD数据库五味子甲素、五味子乙素相关靶点，得到五味子甲素、五味子乙素靶点1 162个.检索GeneCards、OpenTargets Platform癌症相关靶点，分别得到癌症靶点各1 000个.将五味子甲素、五味子乙素靶点和癌症靶点导入Venny2.1.0软件，去重得到64个五味子甲素、五味子乙素抗癌靶点(图1).将五味子甲素、五味子乙素及64个抗癌靶点导入Cytoscape3.6.1软件，得到五味子甲素、五味子乙素-抗癌靶点网络图(图2)，其中36个为五味子甲素抗癌靶点，26个为五味子乙素抗癌靶点，CYP17A1、ATR为五味子甲素、五味子乙素共有作用抗癌靶点.

图1 五味子甲素、五味子乙素-抗癌靶点韦恩图图2 五味子甲素、五味子乙素-抗癌靶点网络

2.2 五味子甲素、五味子乙素抗癌靶点PPI网络

如图3所示，PPI网络中共有64个节点，576条连线.圆形节点的大小表示连接度的大小，圆形节点越大表示其连接度越大，圆形节点的周线越粗代表其介度越大.对连接度、介度及紧密度进行分析，筛选得到18个连接度、介度及紧密度均在平均值之上的靶点作为五味子甲素、五味子乙素抗癌关键靶点.其中平均连接度为18，平均介度为1.31×10-2，平均紧密度为5.66×10-1，如表1所示.在18个关键靶点中，主要包括细胞增殖及凋亡相关蛋白MAPK1、MAPK3、MTOR、JAK2、BRCA1；炎症因子PTGS2、TLR4；血管生成相关靶点EGFR、EGF、KDR；信号转导蛋白SRC、HSP90AA1；性激素相关受体AR、ESR1.说明五味子甲素、五味子乙素可能是通过调节以上受体、酶、信号传导蛋白、炎症因子等发挥抗癌作用的.

图3 靶点PPI网络Fig.3 The PPI network of targets

表1 关键靶点及其拓扑参数Tab.1 The key targets and their topological parameters

2.3 五味子甲素、五味子乙素抗癌靶点的GO富集

运用OmicShare云平台进行GO富集分析，筛选出P<0.001的GO条目51个，其中生物过程(biology process)25个、分子功能(molecular function)10个、细胞组成(cellular componet)16个.如图4所示，生物过程主要涉及刺激反应、生物过程调节、细胞增殖、生物附着等；分子功能主要涉及催化活性、抗氧化活性、结构分子活性等；细胞组成主要涉及细胞器、细胞膜、细胞连接等.图5为GO条目气泡图，由图可见富集因子(rich factor)大的前三条GO条目都是关于蛋白激酶B信号及其调节的，说明五味子甲素、五味子乙素的抗癌作用与蛋白激酶B密切相关.

图4 五味子甲素、五味子乙素-抗癌靶点的GO功能分析Fig.4 GO function analysis of schisandrin A and schisandrin B-anticancer targets

2.4 五味子甲素、五味子乙素抗癌靶点KEGG通路

如表2所示，依据P<0.05筛选得到与抗癌密切相关的通路有20条.P取值范围[0，1]，以颜色表示，越红表示P越小，说明富集越明显.圆圈的大小表示该通路下富集的靶点个数，圆圈越大表示映射在该通路的基因数越多.由图6可见，富集因子最大的通路是膀胱癌和前列腺癌，参与靶点最多的通路是癌症通路和PI3K-Akt信号通路.

表2 KEGG信号通路信息Tab.2 KEGG signal pathway information

2.5 五味子甲素、五味子乙素抗癌关键靶点的分子对接

通过PPI网络得出的18个关键靶点中，综合比较，选择介数、度值、最短路径排名第一和第二的EGFR、EGF靶点来进行分子对接.由表3可知，这两个靶点与五味子甲素、五味子乙素亲和力均小于-20.92 kJ/mol，其中表皮细胞生长因子受体(图7)的亲和力为-30.96 kJ/mol，表皮细胞生长因子(图8)的亲和力为-27.20 kJ/mol，它们与五味子甲素、五味子乙素对接的氨基酸残基如表4所示.

表3 五味子甲素、五味子乙素与靶点的分子对接Tab.3 Molecular docking of schizandrin A and schizandrin B with targets

图7 表皮细胞生长因子受体的分子对接模型Fig.7 The docking model of epidermal growth factor receptor

图8 表皮细胞生长因子的分子对接模型Fig.8 The docking model of epidermal growth factor

表4 五味子甲素、五味子乙素作用的氨基酸残基Tab.4 Amino acid residues of schisandrin A and schizandrin B

3 讨论

本研究检索多个化合物靶点数据库、疾病靶点数据库，挖掘出64个五味子甲素、五味子乙素抗癌靶点.通过靶点的蛋白互作分析，发现了18个关键靶点，分别为调控细胞生长的MAPK1、MAPK3、MTOR、JAK2、BRCA1；调控炎症反应的PTGS2、TLR4；参与血管生成的EGFR、EGF、KDR；调控细胞迁移的SRC、HSP90AA1；以及性激素受体AR、ESR1，说明五味子甲素、五味子乙素通过抑制肿瘤细胞生长、调控细胞迁移、抗血管生成、调控炎症等途径发挥其抗癌机制.

通过分析最短路径、介数和度值3个网络参数可知，EGFR及其配体EGF名列一二，是整个PPI网络的核心分子.而EGFR属于酪氨酸激酶家族，是活性肽EGF的跨膜糖蛋白受体，当EGF与EGFR胞外特定位点结合，就会激活胞内的酪氨酸激酶、调节蛋白及酶反应物质，引起细胞增殖、黏附、转移以及血管形成等多重生物效应，在结肠癌、肺癌、乳腺癌、神经胶质瘤等多种癌症的发生发展中起促进作用[9].因此，阻断EGF与EGFR结合被认为是癌症靶向治疗的重要策略之一，为此人们已开发出了吉非替尼等系列EGFR-酪氨酸激酶抑制剂，以及为隔离EGF作用正在研发的CIMAvax-EGF疫苗[10].本研究发现，EGFR和EGF分别是五味子甲素、五味子乙素的靶点，于是将它们两两进行分子对接，结果它们的结合能均小于-20.92 kJ/mol，属于高亲和力，由此推测五味子甲素、五味子乙素可能从上下游双重阻断EGF/EGFR通路，其中沈伊依等[11]也已证实五味子甲素能够靶向EGFR及其下游的SRC，通过减少黏着斑蛋白活化而抑制胰腺癌细胞的迁移与侵袭.

GO富集显示五味子甲素、五味子乙素靶点重在调节蛋白激酶B，蛋白激酶B (PKB) 又称Akt，已被定义为癌基因，在卵巢癌、前列腺癌、结直肠癌、 胰腺癌和乳腺癌等多种癌组织中均有Akt的过度表达和活化[12-13]，蛋白激酶B抑制剂哌立福辛则对人卵巢透明细胞癌ES2细胞有明显的杀伤作用[14].而KEGG分析发现除癌症通路外，五味子甲素、五味子乙素靶点参与最多的通路就属PI3K-Akt通路.PI3K属于磷脂激酶家族，能被上游的EGF/EGFR激活，活化的PI3K使PIP2磷酸化成PIP3，从而激活其下游的靶激酶Akt.激活的Akt从细胞膜异位到细胞核及细胞质，激活或抑制下游靶蛋白，进一步促进细胞增殖、阻止细胞凋亡，该信号通路的激活与癌细胞的增殖、存活、侵袭及血管生成密切相关[15].综合上面的核心靶点、GO条目以及KEGG通路分析，可以清晰发现五味子甲素、五味子乙素主要抗癌机制在于作用于核心靶点EGFR、EGF，阻断PI3K-Akt通路激活，抑制Akt活化.王金桥等[16]已实验证实五味子乙素通过抑制PI3K/Akt信号通路活化，抑制大肠癌细胞增殖，诱导其肿瘤细胞凋亡.戴国梁等[17]结肠癌患者肠道内VEGF/PI3K/Akt信号通路被激活，五味子乙素通过抑制VEGF/PI3K/Akt信号通路抑制SW620细胞的活性和迁移.

综上所述，通过网络药理学方法与分子对接技术，预测了五味子甲素、五味子乙素的抗癌靶点、生物过程及信号通路等，发现了其关键抗癌信号通路轴EGF-EGFR-PI3K-Akt，为进一步深入研究五味子甲素、五味子乙素的抗癌机制提供了参考依据.