珍珠龙胆石斑鱼无水保活过程中滋味变化规律研究

步 营，王 飞，朱文慧,*，励建荣，李学鹏,*，王明丽，郭晓华，劳敏军

(1.渤海大学 食品科学与工程学院/生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心， 辽宁 锦州 121013；2.蓬莱京鲁渔业有限公司， 山东 烟台 265600； 3.山东美佳集团有限公司， 山东 日照 276800；4.浙江兴业集团有限公司， 浙江 舟山 316120)

风味是食物刺激味觉和嗅觉受体而产生的综合生理反应，是评价食品品质的重要指标。水产品中风味物质的种类有很多，已经被鉴定出的呈味物质包括游离氨基酸、低聚糖、有机酸、核苷酸及其关联化合物等滋味成分和挥发性风味成分，这些物质相互作用，表现出对比、变调、相乘、消杀作用和气味的累加、协同、融合、掩盖等，共同产生了独特的水产品风味[5]。由于在保活前暂养停食，饥饿、低温使鱼体产生了一些应激反应，鱼体消耗了部分储备的能量物质，基本营养成分发生了变化，同时鱼肉风味也出现了一定的变化。目前，已经开展了石斑鱼[5-6]、大黄鱼[7]、大菱鲆[8]、花鲈[9]、鲫鱼[9-12]、海鲈鱼[13]等水产品在无水保活过程中的生理生化变化及胁迫机制的研究，但针对鱼类无水保活过程中的风味特征变化规律报道还较少，有待进一步的深入研究。

珍珠龙胆石斑鱼常采用无水保活方式进行运输，本研究拟以珍珠龙胆石斑鱼为研究对象，探讨其在低温无水保活过程中呈味成分的变化规律，希望为珍珠龙胆石斑鱼保活运输中滋味品质保持与提升提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

珍珠龙胆石斑鱼，购自锦州市林西路水产市场。挑选健康无疾病，体表完好的石斑鱼作为实验样品，质量为(800±50)g，充氧(纯氧)运输至实验室后，将其放入配置的人工海水中，水温为(22±0.5)℃，溶氧为6 mg/mL，盐度为2.7%±0.2%，暂养24 h以消除应激反应。

磷酸二氢钾，分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司；乳酸、琥珀酸、柠檬酸、腺嘌呤核糖核苷酸(adenosine monophosphate，AMP)、次黄嘌呤核苷酸(inosinemonphosphate，IMP)、鸟嘌呤核苷酸(guanosine monophosphate，GMP)，均为色谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；高氯酸，分析纯，福晨(天津)化学试剂有限公司；甲醇，色谱纯，德国西格玛公司。

1.2 仪器与设备

MS105DU型电子分析天平、PE28型pH计，梅特勒托利多仪器(上海)有限公司；1100型高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；L- 8900型氨基酸分析仪，日本日立公司；SA- 402B型电子舌，日本Insent公司；C18型液相色谱柱，美国安捷伦公司；Biofuge Stratos型高速冷冻离心机，美国Thermo公司。

1.3 实验方法

珍珠龙胆石斑鱼停食暂养24 h后，以2 ℃/h速率匀速降温至14 ℃，迅速将鱼捞出，放入自封袋中，充入纯氧后，封口，置于15 ℃生化培养箱中保存，分别于0、3、6、9、12 h取样一次。取样时采用木棒击打头部致死，采集其肌肉组织，随后将其放入-80 ℃冰箱保存，以便后期指标测定。

1.3.1电子舌分析

参照祝伦伟[14]的方法稍做修改。准确称取5.0 g石斑鱼肉放在100 mL小烧杯中，加入95 mL蒸馏水，高速均质机均质，4 ℃、8 000 r/min条件下离心10 min，取上清液，稀释3倍，用0.45 μm滤膜过滤备用。取70 mL过滤后的样品液于测试杯中，使用电子舌传感器C00、AE1、AAE、CA0和CT0在室温下对样品的苦味、苦味回味、涩味、涩味回味、鲜味、酸味、丰富度和咸味分别进行分析。

1.3.2核苷酸测定

参考祝伦伟[14]的方法略有修改。

标准曲线的绘制：将AMP、IMP、GMP 3种核苷酸混合标准溶液配制成0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL等系列浓度标准溶液。所得标准曲线依次为：y=22 711x+410(R2=0.997)，y=36 672x-73.945(R2=0.998)，y=40 474x-118.25(R2=0.997)。

样品前处理：取5 g石斑鱼鱼肉，绞碎，加入15 mL体积分数为5%的高氯酸溶液，匀浆后在4 ℃条件下4 500 r/min离心10 min，取上清液。沉淀中再次加入10 mL高氯酸，再次匀浆离心(条件同上)。将两次得到的上清液合并后摇匀，用5 mol/L的KOH调节pH值至6.75，过0.22 μm滤膜。

色谱条件：C18柱(5 μm, 4.6 mm×250 mm)；流动相为pH值为4.3的0.05 mol/L的KH2PO4-甲醇溶液，进样前超声10～15 min脱气；流速为0.8 mL/min，进样量为10 μL，紫外检测器波长为254 nm。采用梯度洗脱，程序为0～10 min，KH2PO4与甲醇的体积比为97.5∶2.5；10～17 min，KH2PO4与甲醇的体积比为85∶15；17～20 min，KH2PO4与甲醇的体积比为97.5∶2.5。

1.3.3有机酸测定

参考杨婉琳[15]的方法略有修改。

标准曲线的绘制：将混合标准溶液(包含乳酸、柠檬酸和琥珀酸等3种有机酸)配制成0.01、0.10、0.25、0.50、1.00 mg/mL的标准溶液；将标准溶液在相同的液相条件下分别进样，以峰面积与对应的质量浓度(mg/mL)绘制3种有机酸标准曲线，并采用外标法进行定量。3个有机酸的标准曲线依次为：y=572.47x-4.496 2(R2=0.999)，y=714.2x+7.466 9(R2=0.993)，y=1 513.6x-30.767(R2=0.997)。

样品前处理：取5 g石斑鱼鱼肉，绞碎后加入15 mL体积分数为5%的高氯酸溶液，高速均质机匀浆后静置20 min，4 ℃、7170 r/min离心10 min，上清液经0.22 μm滤膜过滤，待高效液相色谱进样分析。

色谱条件：C18柱(5 μm, 4.6 mm×250 mm)，柱温为25 ℃；检测器为紫外吸收检测器，检测波长为205 nm；流动相为甲醇与KH2PO4(0.01 mol/L, pH值为2.8，二者体积比为5∶95)，流速为0.5 mL/min，进样量10 μL，等梯度洗脱。

1.3.4游离氨基酸测定

参考邓婕春等[16]的测定方法并修改。准确称取鱼肉样品3 g，加入质量分数为15%的三氯乙酸50 mL，均质后静置2.5 h，12 000 r/min、4 ℃条件下离心20 min。取5 mL上清液，用3 mol/L NaOH将溶液pH值调节至2.0～2.5，加入蒸馏水定容至10 mL，摇匀后静置10 min，过0.45 μm滤膜得到待测液。

氨基酸自动分析仪的条件设置：分离柱温度为57 ℃，检测波长为570 nm，缓冲溶液流速为0.4 mL/min；反应液为茚三酮试剂，反应液流量为0.35 mL/min；反应单元温度为135 ℃，进样量为20 μL。

1.4 数据分析

采用Excel 2010软件对数据进行整理，采用Origin Pro 9.0软件绘制曲线图，SPSS 24.0软件对数据进行差异性分析。显著性分析采用Duncan多重比较法，P<0.05表示差异显著，数值采用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 石斑鱼无水保活过程中电子舌分析结果

电子舌或味觉传感器是用来确定感官属性最常用的工具之一[17]。表1是样品按体积比稀释30倍后电子舌的测定结果。由表1可知，样品中的酸味、涩味、咸味均为负数，表明其无法被人类味觉所感知，而苦味和浓厚味的响应值明显高于其他滋味。鲜样具有较高的苦味和苦味余味响应值，并且鲜味和涩味余味的响应值较低。无水保活后，与对照组相比，在0～3 h时，鲜味值显著增加至最大值4.13。这可能是因为石斑鱼在短时间降温后，鱼体为适应低温环境，通过积聚氨基酸抵抗冷胁迫，亲水性氨基酸，如天冬氨酸、苏氨酸和丝氨酸能使机体中的结合水含量增加，有助于应对低温[18]；而天冬氨酸为鲜味氨基酸，苏氨酸、丝氨酸属于甜味氨基酸，能够降低苦味，增加鲜味。保活3～12 h后，鲜味值逐渐缓慢降低，12 h后降为3.52，但仍高于鲜样。这可能是因为随保活时间延长，石斑鱼再次产生胁迫反应，体内代谢再次发生变化，产生一定量的多肽，以及不同呈味氨基酸含量发生变化，因而表现为鲜味增加、苦味降低。在12 h后，浓厚味值增加至最大值，为5.00。

表1 不同保活时间后珍珠龙胆石斑鱼鱼肉电子舌分析结果Tab.1 Analysis results of electronic tongue of pearl gentian grouper with different keeping alive time

图1为电子舌PCA分析结果，由图1可知，PC1和PC2的贡献率分别为68.22%和22.07%，累积贡献率为90.29%，因此，PC1和PC2包含了大量信息，可以反映样本的总体特性。图1中所有样品的数据采集点分散，0 h与其余各组距离较远，鲜样与3、6 h距离较为接近，9 h与12 h较为接近，结合表1数据可以表明，保活3 h之后，石斑鱼鱼肉的滋味得到较大改善，12 h后其浓厚味最佳。

图1 不同保活时间后珍珠龙胆石斑鱼鱼肉的电子舌PCA分析结果Fig.1 Electronic tongue PCA analysis results of pearl gentian grouper with different keeping alive time

2.2 石斑鱼无水保活过程中核苷酸含量变化

鲜味被定义为谷氨酸引起的特征味觉，研究表明，AMP、IMP、GMP等核苷酸也能提供一定的鲜味。此外，还发现核苷酸和鲜味氨基酸之间存在协同作用，当它们以一定的比例混合时能产生更强烈的鲜味[19-20]。IMP、GMP和AMP是鱼肉中的3种主要呈味核苷酸，其中IMP和AMP可以通过ATP的分解产生。在生物体内，IMP有两种转化方式：一部分会参与能量循环，转变成运输能量的物质ATP，为细胞活动提供能量；另一部分在酶的作用下进一步分解为GMP和AMP，为DNA的合成提供物质基础。无水保活后，鱼肉中的核苷酸变化如表2。表2显示：随着无水保活的时间增加，IMP含量随保活时间呈现先上升后下降的趋势(P<0.05)，在保活3 h后含量达到最大值(465.0 mg/100g)；AMP含量无显著变化；GMP是IMP转化的产物，GMP在保活期间也呈现先上升后下降的趋势，保活前期，石斑鱼为抵抗低温，消耗的ATP较多，而IMP降解速度较慢，造成IMP的积累；保活后期，IMP含量的降低一方面可能是由于石斑鱼在保活后期新陈代谢速率降低，能量消耗较少，分解的ATP较少[21]，另一方面，可能是无水保活导致鱼体内的碱性磷酸酶活性上升，导致IMP降解增加[22-23]。滋味活性值(taste active value, TAV)是滋味物质浓度与该物质的阈值的比值。TAV反映了单一化合物对滋味的贡献，TAV小于1表示该物质对滋味贡献不大，TAV大于1表示该物质对滋味贡献较大，且数值越大，贡献越大。各处理组IMP的TAV均大于1，说明IMP对珍珠龙胆石斑鱼的滋味有重要贡献。经保活12 h后，与鲜样相比，IMP的含量降低了60%，其TAV降低至7.20。保活12 h后，核苷酸总量显著下降，比保活前降低了58.59%。本研究表明，无水保活不利于石斑鱼核苷酸类呈味物质的积累。

表2 不同保活时间后珍珠龙胆石斑鱼鱼肉的核苷酸含量变化Tab.2 Changes in nucleotide content of pearl gentian grouper with different keeping alive time mg/100 g

2.3 石斑鱼无水保活过程中有机酸含量变化

有机酸具有一定的呈味作用，柠檬酸略带果香的酸味，琥珀酸呈现出酸鲜味，乳酸具有爽口的酸味。柠檬酸是有机酸中的第一大酸，琥珀酸与柠檬酸、谷氨酸钠或氯化钠等具有协同增鲜的作用，能显著增强鲜味。表3为不同保活时间后珍珠龙胆石斑鱼鱼肉的有机酸含量变化情况。由表3可以看出，鱼肉中乳酸含量显著增加，这可能是在无水保活过程中，鱼体的有氧呼吸受到抑制，无氧呼吸增强，从而导致乳酸在肌肉中积累，这与丁亚涛等[24]对鳊鱼无水保活的研究结论一致。鱼肉中柠檬酸含量在保活后均呈先增加后降低的趋势，琥珀酸含量呈现出先降低后增高的趋势。琥珀酸及柠檬酸均为三羧酸循环的中间物质，正常情况下，其变化不大，而当有氧呼吸被抑制时，两种有机酸含量会受到一定的影响。在保活前期，鱼体因冷胁迫，通过加强代谢御暖抗寒，此时有氧呼吸相对旺盛；保活后期，可能由于包装袋内二氧化碳的积累，抑制了鱼体有氧呼吸，从而导致鱼体通过无氧呼吸为机体提供能量[25]。各处理组鱼肉中乳酸含量差异显著(P<0.05)，保活12 h后乳酸达到最大值，为158.70 mg/g，是鲜样的1.40倍。保活1.2 h后，琥珀酸和柠檬酸含量分别增加了11.2%和12.7%，与周翠平[26]研究结果一致。各处理组琥珀酸、乳酸和柠檬酸的TAV值均大于1，说明3种有机酸对石斑鱼的滋味有重要贡献。无水保活后，鱼肉中有机酸总量增加，表明其鲜味比保活前有所增加，对鱼肉的滋味有一定的改善。

表3 不同保活时间后珍珠龙胆石斑鱼鱼肉的有机酸含量变化Tab.3 Changes in organic acid content of pearl gentian grouper with different keeping alive time

2.4 石斑鱼无水保活过程中游离氨基酸含量变化

鱼肉中的氨基酸种类及含量与捕鱼的季节以及饲料中的成分有关[28]，通常情况下认为鱼肉经过处理或者贮藏后，其游离氨基酸的含量及组成会发生较大变化。表4是石斑鱼径无水保活后在不同时间的游离氨基酸含量的变化情况。由表4可知，丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸经冰温处理后有显著升高(P<0.05)。鲜味氨基酸中谷氨酸、天冬氨酸变化较大，呈先上升后下降的趋势，保活3 h达到最大值，含量分别为41.50、7.29 mg/100 g，显著高于鲜样的8.54、0.60 mg/100 g。甜味氨基酸中丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸的平均值较鲜活鱼大幅提高。与鲜样组相比，休眠处理组鱼肉中的游离氨基酸总量(total free amino acid, TFAA)和必需氨基酸(essential amino acid, EAA)分别是保活前的3.70倍和3.04倍，说明无水保活后石斑鱼肉蛋白质营养价值得到提升。石斑鱼中具有甜味的氨基酸含量相对较高，是主要呈味成分。无水保活后，甜味氨基酸(SAA)与苦味氨基酸(BAA)含量呈先上升后下降的趋势，保活后其含量分别是保活前的6.19倍和2.38倍；鲜味氨基酸(DAA)含量是保活前的1.81倍，其中丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸和赖氨酸无水保活后显著增加，除赖氨酸呈苦味，其他3种氨基酸均呈甜味，这表明无水保活有利于鱼体内游离氨基酸含量的提升，且使得鱼肉的鲜甜滋味得到改善。牙鲆在低温无水保活60 h后，天冬氨酸、丝氨酸、丙氨酸和精氨酸下降程度超过10%，而胱氨酸则增加了27.3%[29]；鲟鱼低温保活过程中，游离氨基酸态氮含量先上升后下降，在12 h达到最大值，与本研究中鱼肉的游离氨基酸变化趋势一致。在低温胁迫下，蛋白质会被水解为各种氨基酸，为抗应激相关蛋白质的合成与周转提供原料，同时起到抗应激的功能[30]。在低温无水条件下，游离氨基酸增加可能是因为鱼体通过分解蛋白质获得能量及调节体内代谢抵抗寒冷，从而增强自身的抗寒能力。

3 结 论

本研究发现，无水保活过程对石斑鱼的滋味有较大影响，乳酸、琥珀酸、乳酸和柠檬酸等滋味成分对珍珠龙胆石斑鱼的滋味有重要贡献。经无水保活后，鱼肉中有机酸总量和呈鲜味、甜味的游离氨基酸含量均显著增加；而呈味核苷酸含量呈现先增加后下降的趋势。经无水保活后，鱼肉总体呈现出鲜味先增加后降低的趋势，但仍高于鲜样，苦味呈先增加后降低的趋势，但仍低于鲜样；浓厚味呈增加的趋势，这是鱼肉中的核苷酸、有机酸及游离氨基酸共同呈味作用的结果。无水保活后，有机酸和游离氨基酸含量的增加，不仅有利于鱼肉滋味的改善，同时也提高了鱼肉的营养价值，这表明无水保活提高了鱼肉的品质，有利于鱼肉的进一步加工。

表4 不同保活时间后珍珠龙胆石斑鱼鱼肉游离氨基酸含量变化Tab.4 Changes in free amino acid content of pearl gentian grouper with different keeping alive time mg/100 g