小偃麦渗入系苗期耐盐鉴定与分子标记评价

乔麟轶，张潇文，李世姣，陈芳，李欣，郭慧娟，张树伟，常利芳，张晓军，畅志坚

（1.山西农业大学农学院／作物遗传与分子改良山西省重点实验室，山西 太原 030031；2.山西大学生物工程学院，山西 太原 030006）

土壤盐渍化严重影响作物的正常生长和产量。目前我国东北、西北、黄河三角洲及沿海等地区的盐渍化土壤面积高达3.6×107hm2［1，2］，已成为限制作物增产的主要因素之一。小麦是我国的主粮作物，随着人口增长对粮食需求的不断加大，增强小麦对盐渍土壤的耐受性进而提高其产量，对于保障国家的粮食安全意义重大。

广泛发掘耐盐种质是选育小麦耐盐品种的前提。偃麦草属 （Thinopyrum）植物隶属禾本科小麦族，可在盐碱地或滩涂生长，是小麦抗逆性改良的优异基因库［3］。长期以来，育种家通过远缘杂交或体细胞融合技术将偃麦草遗传片段导入小麦，创制了小偃麦种质，并据此选育出耐盐品种用于生产［3-5］。例如源自中间偃麦草 （Th.intermedium）的山农120211［6］和源自长穗偃麦草 （Th.ponticum）的小偃6号［7］、山融3号［8］都表现出很好的耐盐性。其中，山融3号携带的耐盐基因被定位在5A染色体上［9，10］。

本实验室自1986年起利用染色体异源重组将中间偃麦草片段转移至普通小麦，创制了TAI7045、TAI7047和TAI8335等多个八倍体小偃麦新类型［11-13］，并将其与普通小麦品种杂交、回交，获得一批兼抗小麦白粉病和条锈病的小偃麦新种质［14，15］。本研究从小偃麦TAI7047的后代渗入系中选出136份染色体数目为42的材料进行苗期耐盐性鉴定，并利用分子标记对其进行评价，以期为小麦耐盐育种提供新种质及耐盐新抗源。

1 材料与方法

1.1 供试材料

136份小偃麦渗入系 （晋麦33／TAI7047／／*2京411的F9～F10家系）及其亲本用于苗期耐盐鉴定，小麦品种山融3号和中国春分别作为耐盐和盐敏感对照材料。其中，山融3号由山东省农业科学院作物研究所刘成研究员提供，其余材料均由作物遗传与分子改良山西省重点实验室提供。

1.2 盐胁迫处理

每份材料取25粒种子，先用1%的双氧水消毒，再用蒸馏水冲洗干净，然后放置于培养皿中萌发。待胚根伸长至2～3 cm时，选择16粒生长势一致的种子转移到培养箱中的1／2霍格兰氏营养液中生长，参数设置为16 h光照／8 h黑暗、22℃／16℃；待幼苗生长至两叶一心期时更换含NaCl的1／2霍格兰氏营养液进行盐胁迫，再生长7 d进行表型鉴定。试验设3次重复。

预试验设置0、50、100、150、200、250、300、350 mmol／L NaCl共8个浓度对耐盐对照山融3号和盐敏感对照中国春进行苗期耐盐鉴定，选择两者耐盐表型差异最大时的处理浓度来鉴定渗入系材料。

1.3 表型鉴定与数据分析

参考单雷等［9］的方法，根据农业农村部《小麦耐盐性鉴定评价技术规范》（NYΠPZT0012.2002）将小麦耐盐级别划分为0～4级，对每个材料的16株幼苗分别进行小麦叶片的盐害程度鉴定，并计算盐害指数。计算方法为：盐害指数（%）＝∑（0×0级苗数＋1×1级苗数＋2×2级苗数＋3×3级苗数 ＋4×4级苗数）×100／（5×16）。

根据盐害指数评价材料耐盐性，评价标准为：高耐（0～20.0%），耐盐 （20.1%～40.0%），中耐（40.1%～60.0%），敏感 （60.1%～80.0%）和高感 （80.1%～100.0%）。

采用Microsoft Excel 2007软件处理数据、作图以及数据统计分析。

1.4 分子标记检测

采用改良CTAB法［16］提取供试材料及对照品种的基因组DNA。利用山融3号耐盐基因的连锁分子标记Xbarc144（F：5′-GCGTTTTAGGTGGACGACATAGATAGA-3′；R：5′-GCGCCACGGGCATTTCTCATAC-3′）［10］对小偃麦渗入系进行PCR鉴定。PCR反应体系为10μL：ddH2O 3.5μL，PCR Mixture 5.0μL（B532061，生工生物，中国上海），引物0.5μL，DNA模板 （100 ng／μL）1.0μL。PCR扩增程序：95℃预变性3min；95℃变性30 s，58℃复性30 s，72℃延伸30 s，共35个循环；72℃延伸10 min，12℃保存。PCR扩增产物利用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶（Acr∶Bis＝29∶1）电泳检测，硝酸银染色后照相保存结果。

2 结果与分析

2.1 苗期耐盐鉴定浓度筛选

以耐盐对照山融3号和盐敏感对照中国春为测试材料，设置0～350 mmol／L NaCl共8个浓度进行苗期耐盐鉴定。结果（图1）显示，随着NaCl浓度的增加，测试材料的盐害指数逐渐增加。在250 mmol／L NaCl浓度下，山融3号和中国春的盐害指数分别为35.4%和73.6%，差异达到最大值，因此将250 mmol／L作为对渗入系材料进行耐盐筛选的鉴定浓度。

图1 小麦苗期耐盐鉴定浓度的筛选

2.2 渗入系材料苗期耐盐鉴定

对136份小偃麦渗入系及其亲本进行苗期耐盐评价。结果显示，外源亲本TAI7047的盐害指数为29.26%，具有耐盐性；而小麦亲本晋麦33和京411则表现为盐敏感，盐害指数分别为63.17%和70.83%。小偃麦渗入系中，耐盐、中耐、敏感、高感材料的数量分别为9（6.6%）、62（45.6%）、62（45.6%）和3（2.2%）份，其中，有6份渗入系（CH01、CH1631、CH1696、CH1715、CH3286和CH16425）的盐害指数低于对照品种山融3号，表现出很好的耐盐性（图2，表1）。

2.3 苗期耐盐渗入系的分子标记评价

利用山融3号的耐盐基因连锁标记Xbarc144对136份小偃麦渗入系及其亲本进行PCR鉴定。结果显示，Xbarc144在盐敏感小麦亲本晋麦33、京411和耐盐亲本TAI7047间存在多态性，并在小偃麦渗入系中表现出4种标记型，其中Xbarc144-a和Xbarc144-b型分别来自于晋麦33和京411，Xbarc144-c和Xbarc144-d型则来自于TAI7047（图3）。然而方差分析结果 （表2、表3）显示，4种标记型对应的盐害指数之间无明显差异 （F＝0.27＜F0.05），表明Xbarc144标记与这批渗入系的耐盐表型不连锁。

图2 136份小偃麦渗入系的苗期耐盐等级和分布

表1 6份耐盐渗入系及其亲本和对照材料的苗期耐盐表型和标记型

表2 Xbarc144在136份小偃麦渗入系中的4种标记型对应盐害指数

表3 Xbarc144的4种标记型对应表型值的方差分析

图3 Xbarc144标记在部分小偃麦渗入系及其亲本中的标记型

3 讨论

育种家通常将高产、优质和抗病等性状作为主要育种目标，对耐盐等抗逆表型的关注相对较少。有研究表明，现代小麦品种的整体耐盐性几乎没有提升，而遗传多样性持续下降，优异耐盐单倍型较为单一［7］。因此，从小麦近缘物种中广泛发 掘 耐 盐 位 点 尤 为 重 要。 例 如Byrt［17］和Munns［18］等从一粒小麦 （Triticum monococcum）的渐渗系中鉴定出一个主效耐盐位点Nax2，并确定TmHKT1；5为候选基因，导入TmHKT1；5-A的四倍体小麦在盐碱地中增产达25%。而偃麦草属盐生植物含有更为丰富的耐盐基因，本实验室历经30余年将中间偃麦草片段导入小麦，创制了一大批小偃麦渗入系。本研究对八倍体小偃麦TAI7047的渗入系进行苗期耐盐鉴定，共筛选出71份耐盐材料，其中有6份材料的耐盐性高于对照品种山融3号，可为小麦耐盐遗传改良提供新种质及耐盐新抗源。

鉴定结果显示，这批渗入系的小麦亲本晋麦33和京411均为盐敏感材料，而亲本八倍体小偃麦TAI7047则表现为耐盐，表明耐盐性来源于TAI7047。TAI7047中导入了中间偃麦草的2条J染色体、6条Js染色体、3条St染色体和2条Js-St染色体［12，19］，初步猜测其耐盐性可能来源于中间偃麦草，对此我们将检测TAI7047系谱亲本的苗期耐盐表型进行验证。

由于小麦耐盐品种山融3号的耐盐基因来源于长穗偃麦草，而中间偃麦草（JJsSt）与长穗偃麦草 （JJsJx）具有相似的基因组组成［20］，因此我们用山融3号耐盐基因的连锁标记Xbarc144对小偃麦渗入系进行PCR鉴定，结果显示渗入系的耐盐表型与Xbarc144不连锁，可能包含新的耐盐位点，这将有助于拓宽小麦的遗传背景。

4 结论

利用250 mmol／L NaCl对136份小偃麦渗入系进行苗期耐盐鉴定，从中选出71份耐盐材料，其抗性来自于亲本TAI7047。有6份渗入系的耐盐性（盐害指数31.25%～35.94%）略高于对照品种山融3号 （盐害指数38.45%），可为小麦耐盐遗传改良提供新种质。本研究中渗入系耐盐表型与山融3号的耐盐连锁标记Xbarc144不连锁，可能具有新的耐盐位点，拓宽了小麦的耐盐遗传背景。