小麦新品种济麦70籽粒发育过程中细胞形态及内源激素的动态变化分析

李永波，崔德周，黄琛，隋新霞，樊庆琦，楚秀生，2

（1.山东省农业科学院作物研究所／农业部黄淮北部小麦生物学与遗传育种重点实验室／小麦玉米国家工程实验室，山东 济南 250100；2.山东师范大学生命科学学院，山东 济南 250014）

小麦是全球最重要的粮食作物之一。小麦颖果由外向内依次由外果皮、种皮、糊粉层和胚乳组成［1］。在小麦籽粒发育过程中，外层果皮和内层胚乳细胞会发生程序性细胞死亡（PCD），表现为染色质凝集、核DNA降解以及核酸酶活性增加等［2］。籽粒的这种PCD是为蛋白质和淀粉合成提供场所以及为其它细胞提供能量供应［3，4］，其进程直接影响小麦灌浆、籽粒大小和品质。因此，研究小麦籽粒PCD及相关细胞形态的动态变化对培育高产优质小麦新品种具有重要的理论指导意义。

植物PCD是内部基因有序地调控组织细胞降解的过程，对维持机体的正常生长发育及适应外界环境因子的胁迫具有重要意义［5］。种子成熟过程中，PCD的发生受干旱［6］、涝害［7］、激素等多种环境因素的影响。干旱可以促进线粒体释放细胞色素C，进而导致PCD［6］；涝害会引起胚乳细胞染色质凝聚、核退化、线粒体破裂等PCD特点［8］；花后高温会加速小麦胚乳细胞的降解［9］；乙烯会加速小麦种子PCD，而ABA则延迟PCD［10］。小麦籽粒发育过程中会应对干旱、干热风等各种复杂多变的环境，环境因子决定了籽粒PCD进程，因此研究小麦籽粒PCD的动态变化过程对适应外界环境胁迫、保证后期籽粒正常灌浆意义重大。

本研究以高产稳产、抗倒、广适小麦新品种济麦70为材料，探究其籽粒发育过程中内部细胞形态变化与PCD进程的对应关系及内源激素ABA的动态变化，以期为进一步探究PCD调控小麦籽粒发育的分子机理奠定重要理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

小麦新品种济麦70由山东省农业科学院作物研究所培育，于2020年通过山东省农作物品种审定委员会审定，编号为鲁审麦20200005，其主要特点是产量潜力高、高抗倒伏、抗病性好、广适等。

1.2 番红固绿染色

取开花后5、10、15、20、25 d具有代表性的小麦籽粒3粒进行石蜡切片。依次将切片放入二甲苯中20 min，无水乙醇中5 min，75%乙醇中5 min，然后用自来水清洗。清洗好的片子放入番红染液中染色1～2 h，用自来水洗去多余的染料。接下来将切片依次放入50%、70%、80%梯度乙醇中各3～8 s，然后放入固绿染液中染色30～60 s，用无水乙醇进行脱水。最后，将切片置于二甲苯中透明5 min，然后用中性树胶封片，用荧光显微镜（Axiocam，卡尔蔡司，Germany）进行拍照（放大100倍）。

1.3 DNA梯度检测

取开花后5、10、15、20、25 d的小麦籽粒，用细胞凋亡-DNA Ladder抽提试剂盒（C30007，碧云天，上海）对籽粒中的DNA进行分离，具体操作详见说明书。取1μg DNA上样，用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测。

1.4 内源性激素测定

利用植物激素的酶联免疫吸附测定法，对小麦籽粒中的内源激素进行测定，具体操作步骤详见文献［11］。

2 结果与分析

2.1 小麦籽粒内部细胞形态动态变化与其PCD进程动态关系

对开花后5、10、15、20、25 d的小麦品种济麦70籽粒进行番红-甲基绿染色和DNA梯度检测分析，结果显示，开花后5 d，所有籽粒细胞呈椭圆形，扇状排布，细胞没有出现分化现象；开花后10 d，细胞出现明显的分化现象，最内部致密的胚乳细胞、包裹着胚乳的1～2层糊粉层细胞、单层种皮细胞以及最外面的多层果皮细胞等出现；开花后15 d，果皮细胞层数减少，胚乳细胞开始皱缩；开花后20、25 d，果皮只有单层细胞，而胚乳细胞出现破裂（图1）。DNA梯度检测结果显示，只有到达开花后15 d时，DNA片段的断裂现象才开始出现，表明在开花后15～25 d范围内，小麦籽粒细胞正在发生PCD（图2）。综上所述，小麦籽粒果皮细胞层数的减少及胚乳细胞的皱缩、破裂现象是一种PCD过程。

图1 小麦籽粒内部细胞形态结构（100×）

图2 DNA梯度检测

2.2 内源植物激素的动态变化

对开花后不同时间点济麦70籽粒内源植物激素含量的分析结果（图3）显示，脱落酸（ABA）含量在开花后5～10 d呈现下降趋势，10～25 d一直保持上升趋势；生长素（IAA）含量在开花后5～10 d呈现上升趋势，10～20 d下降，之后又上升；赤霉素（GA）含量在5～15 d呈现下降趋势，15～20 d快速上升，20～25 d保持平稳；而玉米素核苷（ZR）却在5～25 d持续下降。可以看出，只有脱落酸含量的变化趋势与籽粒PCD的发生时间比较吻合，因此推测，小麦籽粒发育后期脱落酸含量的增加，可能促进了小麦籽粒PCD的发生；但是籽粒发育期间所出现的细胞形态变化，可能是由多种内源植物激素协同作用的结果。

图3 花后5～25 d小麦籽粒内源植物激素含量变化

3 讨论与结论

小麦作为重要的粮食作物，其籽粒灌浆与产量和品质息息相关。小麦籽粒早期发育过程中会出现细胞数目增加、细胞分化、PCD以及内源植物激素变化等现象，进而为后期灌浆做准备［12-14］。本研究发现，ABA在小麦籽粒早期发育过程中持续增加，而前人研究表明ABA是影响籽粒胚乳PCD的关键因子，可通过影响乙烯合成途径影响胚乳PCD［15］，因此，推测籽粒早期的PCD现象可能受ABA调控。

小麦颖果在发育早期会出现果皮厚度变薄、细胞层数减少的现象。根据形态学及淀粉积累程度特点，可将籽粒果皮的发育过程分为生长期、形成期、消失期和成熟期［9，16］。本研究发现，花后15 d出现果皮层数减少、胚乳细胞破裂并伴随PCD现象，推测此时果皮已进入消失期，通过PCD为籽粒灌浆扩容提供容纳淀粉的充足内部空间。小麦籽粒早期的发育过程，会经历细胞分裂、细胞分化、PCD现象，并伴随着植物内源激素的不断变化，这种种变化是为保证其籽粒灌浆能够顺利进行而准备的。小麦籽粒发育过程中的PCD发生部位是在果皮和胚乳细胞中，如小麦品种华麦8果皮细胞在花后0～15 d完成PCD过程［3］，新冬18和新冬22胚乳细胞在花后15～25 d完成PCD［6］，而小麦新品种济麦70在花后15～20 d可检测到PCD现象，这是典型的胚乳PCD发生时间，但却在花后5～20 d内完成果皮的降解，这与前人研究相比有所延缓，这种PCD的差异可能与小麦品种以及气候条件差异有关。

尽管本研究对小麦新品种济麦70籽粒早期发育过程中细胞的形态变化、内源植物激素含量以及PCD现象做了初步解析，但对其上游调控PCD的基因是什么、ABA参与调控PCD的分子机理等问题仍需进一步研究。