运动对大鼠慢性高眼压视网膜自噬与凋亡的影响

龙晓雪 杨宏宇 薛艳丽 宋红芳

0 引言

青光眼作为世界第一位不可逆致盲眼病，以视神经萎缩、视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGCs)凋亡、视盘凹陷为主要标志性病变[1]。眼压升高一直是青光眼最危险的因素之一，眼压升高可导致RGCs的凋亡[2]。RGCs属于高度分化的细胞，一旦凋亡便无法补充，因此阻止RGCs在高眼压影响下的凋亡对于防治青光眼尤为重要。细胞凋亡与细胞自噬功能相关。细胞自噬，可以将细胞内多余或受损细胞器包裹并送到溶酶体降解，实现蛋白质的再利用，通过大分子的分解代谢，产生代谢底物，满足饥饿细胞的生物能量需求，从而允许适应性蛋白质的合成[3]。自噬可以与凋亡合作、协助或对抗，从而影响细胞的不同命运，细胞环境的稳定需要这两种细胞死亡模式之间的相互平衡[4]。研究证明，在慢性高眼压动物模型中，细胞自噬相关蛋白LC3-II/LC3-I和Beclin1表达增加，神经节细胞层能看到自噬体的积累，说明慢性高眼压使RGCs中自噬被激活[5-6]，并且RGCs在压力作用下其自噬功能会先被激活来保护细胞，直至压力达到激活凋亡的阈值，才引起细胞凋亡[7]。这些现象提示细胞自噬可能成为青光眼治疗干预的新靶点。

已有研究表明，运动可以影响细胞的自噬与凋亡。一方面，规律的运动锻炼可以降低凋亡水平，对于急性高眼压模型[8-9]、光诱导视网膜损伤模型[10-11]和糖尿病模型[12-13]，运动可以增加脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)的含量水平促进其表达，还能够改善线粒体的功能，减少氧化应激反应，从而减少RGCs的凋亡，减缓视网膜功能的退化。另一方面，运动会引起细胞自噬的变化，根据发挥作用的不同，自噬有两种变化趋势：(1) 运动可激活细胞自噬。短期运动在导致心肌细胞凋亡的同时可以激活心肌细胞的自噬，而长期运动可以降低心肌细胞凋亡，增强其自噬的激活以加强心肌的保护功能[14]。研究表明8周的抗阻训练可以刺激外周血单个核细胞自噬，阻止炎症小体的激活，减少老年人外周血单个核细胞的凋亡[15]。Kwon等[16]提出运动诱导的肝脏细胞自噬与细胞凋亡呈负相关，运动能提高细胞自噬和抗氧化能力，增强合成代谢信号传导，可能是一种有效对抗多种肝脏疾病的非药物治疗策略。(2) 运动可降低细胞自噬。体育锻炼可以减少大鼠短暂性大脑中动脉闭塞模型梗死周围区域神经细胞的自噬体积累、减少细胞凋亡和增强神经功能[17]。游泳运动可改善糖尿病诱导的骨骼肌萎缩的肌肉质量，这提示糖尿病中细胞自噬的激活通过高分解代谢促进了肌肉萎缩，有氧运动通过抑制细胞自噬，可能改变或逆转糖尿病患者的骨骼肌萎缩[18]。由上可见，运动对各部位细胞自噬的影响是多方面的。

目前运动对视网膜内细胞自噬的作用还鲜有研究，尤其是慢性高眼压环境下，运动对视网膜内细胞自噬与凋亡的影响，还有待探索。因此本文对接受与不接受运动训练的慢性高眼压动物模型进行对比实验，研究两种模型视网膜内细胞自噬与凋亡的发生水平，结合RGCs的存活数量，判断细胞自噬发挥的作用，为青光眼的运动治疗方法提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组

选取8周龄雄性SD大鼠32只(体质量260.00 g±20.00 g)，饲养于首都医科大学实验动物中心，适应性喂养3 d后，随机分为空白对照(control，CON)组、中度运动训练(moderate intensity training，MT)组、轻度运动训练(low intensity training，LT)组和静置慢性高眼压(chronic ocular hypertension，COH)组，每组8只。采用正常饮食喂养，12 h循环光照饲养。CON组不做任何处理；MT、LT、COH组为慢性高眼压大鼠模型。本实验得到首都医科大学医学伦理委员会批准。

1.2 运动训练

适应性喂养3 d后，采用大鼠转轮式疲劳仪(YLS-15A，上海玉研科学仪器有限公司)进行运动训练，前3天采用由慢到快、逐渐加速训练，最终步速达到23 m/min。训练成功的标准是大鼠能够以23 m/min的步速完成20 min不间断跑步。随后对MT、LT和COH组进行高眼压造模。造模后MT与LT组继续接受每日运动训练，步速分别为23 m/min(约最大耗氧量70%)和17 m/min(约最大耗氧量58%)[19-20]，持续60 min，每日训练1次，每周训练5 d，持续3周。COH组不做任何运动训练。

1.3 慢性高眼压模型建立

采用烙闭上巩膜静脉并在球结膜下注射25 mg/mL氟尿嘧啶(0.05 mL/只，上海旭东海普药业有限公司)的方法[21]使右眼眼压升高，左眼不做处理。造模成功的标准是左右眼压差高于15 mmHg(1 mmHg=133.322 Pa)并维持3周。

1.4 检测方法

1.4.1 Western blot检测

采用颈椎脱臼法同时处死4组动物,每组各4只。取右眼视网膜，充分裂解，离心后取上清。根据目的蛋白的分子量，配制15% 分离胶，浓缩胶浓度为5%。上样8 μL，浓缩胶恒压90 V，约120 min，分离胶恒压120 V，约90 min。湿转法转膜60 min后5%BSA-TBST封闭60 min。用5%BSA-TBST稀释一抗LC3(1∶1000，CST)， 4 ℃水平摇床孵育过夜。次日5%BSA-TBST稀释二抗(1∶10000，Jackson)孵育。ECL反应液做发光底物，用X线胶片暗室曝光，扫描，用软件Gel Image system ver.4.00 (tanon，中国)分析蛋白条带灰度值。

1.4.2 免疫组化染色

每组各取4只右眼眼球进行石蜡包埋切片。切片脱蜡、水化后浸入EDTA抗原修复液(北京中科万邦生物科技有限公司)并加热进行抗原修复，冷却后加入内源性过氧化物酶阻断剂，PBS冲洗后采用3%BSA对一抗LC3(1∶1000，CST)、Beclin1(1∶100，abcam)、Bax(1∶500，abcam)、Bcl-xl(1∶500，CST)、NeuN(1∶400，CST)进行稀释，37 ℃孵育60 min；滴加反应增强液，37℃孵育20 min；滴加PBS稀释的增强酶标山羊抗兔IgG聚合物(1∶500，Jackson)，37 ℃孵育20 min，DAB显色后复染、封片与观察。采用Image-Pro Plus 6.0(MEDIA CYBERNETICS，美国)软件进行图像分析，以平均积分光密度值(mean of IOD)作为蛋白的阳性表达水平。

1.4.3 数据分析

通过IBM SPSS Statistics 25(IBM，美国)统计分析数据，结果用均数±标准差表示。首先检验数据是否符合正态分布，若符合，统计方法采用单因素方差(one-way ANOVA)分析；若不符合，统计方法采用Kruskal-Wallis H 检验。若P<0.05，认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RGCs数量

3周高眼压模型眼压结果如表1所示。与CON组相比，MT组、LT组、COH组造模右眼眼压明显高于正常眼眼压，有统计学意义，压差在15 mmHg左右，符合高眼压模型标准。且MT、LT、COH三组间眼压没有统计学差异，符合单一变量的原则。各组大鼠RGCs的NeuN染色结果如图1所示，定量分析结果如图2所示。COH组RGCs数量低于CON组，经过运动训练，MT与LT组RGCs数量明显高于COH组。

表1 各组眼压比较

图1 RGCs的NeuN染色

图2 RGCs计数

2.2 自噬表达结果

Western blot条带与半定量分析结果如图3、图4所示。COH组LC3Ⅰ向LC3Ⅱ转化量明显升高，其他3组无差异。免疫组化实验得到的LC3、Beclin1积分光密度值分析结果如图5、图6所示，其中LC3免疫组化与Western blot结果相符。说明慢性高眼压造模会提高LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的转化量并上调Beclin1表达，中度与轻度运动会降低LC3转化量与Beclin1表达量，细胞自噬水平有所降低。

图3 LC3条带

图4 LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的转化量

图5 自噬相关蛋白表达量

图6 视网膜LC3、Beclin1染色

2.3 凋亡表达结果

TUNEL染色显示的凋亡RGCs细胞如图7所示，COH组凋亡细胞数高于另外三组。免疫组化得到的Bax、Bcl-xl积分光密度值分析结果(图8、图9)，Bax蛋白表达COH组明显高于CON、MT、LT三组，Bcl-xl蛋白表达COH组明显低于CON、MT、LT三组。说明慢性高眼压造模会上调Bax表达并下调Bcl-xl表达，中度与轻度运动会降低Bax表达量并提升Bcl-xl表达量，细胞凋亡水平有所降低。

图7 TUNEL凋亡染色

图8 凋亡相关蛋白表达量

图9 视网膜Bcl-xl、Bax染色

3 讨论与结论

本文通过对慢性高眼压大鼠进行中轻度训练，对比研究视网膜细胞自噬与凋亡的情况，通过检测Beclin1、LC3、Bax、Bcl-xl四种蛋白的表达变化，发现中轻度运动会降低LC3转化量与Beclin1、Bax表达量，提升Bcl-xl表达量，说明3周的中轻度训练均可以下调慢性高眼压造成的RGCs自噬与凋亡水平，两种运动强度没有明显差异，说明中度、轻度训练均有利于修复慢性高眼压造成的视网膜损伤。

Beclin1可促进自噬体在细胞应激反应中的形成，自噬成核阶段需要Beclin1[22]。LC3是自噬体膜上的标志性蛋白质，自噬激活时LC3Ⅰ转化为LC3Ⅱ[23]。Beclin1与LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ的表达可作为自噬水平的判断依据。Bax是典型的促凋亡基因，Bcl-xl是主要表达在视网膜的抗凋亡基因，二者的变化可反应凋亡的分子机制[24]。本文通过对这四种蛋白的检测，结合RGCs染色计数及凋亡染色，说明了运动可以降低慢性高眼压动物模型视网膜细胞的自噬与凋亡水平，进而减少RGCs的损失量，对视网膜产生一定的保护作用。

自噬与凋亡是两种不同的程序性细胞死亡机制。细胞受到刺激时，一般自噬先于凋亡发生，自噬的激活在一定程度上可以抑制凋亡的发生；当刺激达到一定阈值，自噬会诱导凋亡的发生。因此，运动引起的自噬水平会有升高、降低两种趋势。

本文研究表明3周的持续高眼压作用下，细胞自噬产生诱导细胞凋亡的作用，运动可以降低细胞自噬水平，与部分疾病模型[17-18]研究结果相符；与其他研究中运动提升细胞自噬水平的结果[14-16]相异。分析原因，一方面可能是疾病模型与正常模型的区别，正常模型中运动提升基础自噬水平产生保护作用，疾病模型中自噬被过度激活，运动通过下降过度的细胞自噬产生保护作用；另一方面可能与运动时间和强度相关。本文中设计了两种运动强度，但产生效果相似，均可以降低细胞自噬与凋亡的水平，提示MT与LT均属于适度运动，运动的其他作用仍需要进一步细化运动分级来验证，比如考虑不同的运动方式[25]。本文就运动影响视网膜细胞自噬的表现进行了说明，但运动信号如何传递至视网膜细胞引起自噬反应，是通过代谢系统还是血液循环系统等原因仍未可知。此外，关于细胞自噬受外界刺激由抗凋亡作用到促凋亡作用转变的临界点仍不明确，可结合自噬发生的分子机制进一步探究。