不同分子分型胶质母细胞瘤中NTSR1的表达及意义

曾 英，钟 鹏，毛成毅，林 俐，杜 娟，付 萍，马 瑜，肖华亮，郭乔楠

胶质母细胞瘤(glioblastoma, GBM)是成人常见的恶性程度最高的脑肿瘤，其具有高度侵袭性，肿瘤极易复发，预后差。手术完整切除后辅以放、化疗，GBM患者的中位总生存期(overall survival, OS)也仅为15～20个月[1]。因此，需要探寻新的治疗靶位以改善患者预后。神经降压素(neurotensin, NTS)作为一种在中枢和外周神经系统广泛表达的神经肽，主要通过神经降压素受体1(neurotensin receptor 1, NTSR1)介导激活下游信号通路。NTSR1通过激活多种信号转导，包括蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPKs)、c-jun-NH-激酶、Rho家族的鸟苷三磷酸酶(RhoGTPase)、黏着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)、核因子κB(nuclear factor kappa-B, NF-κB)以及Wnt/β-catenin，促进细胞存活、增殖、迁移及侵袭[2-5]。研究发现NTS和NTSR1在胶质瘤组织中高表达，特别是在GBM，其表达和胶质瘤级别呈正相关，利用数据库信息分析发现NTS和NTSR1表达预测胶质瘤患者预后差[6]，是GBM患者预后的重要预测指标，然而其在组织样本中的表达及与患者预后的关系尚不清楚，因此本实验检测GBM中NTSR1的表达，分析NTSR1与GBM分子分型、重要分子改变及预后之间的关系，探索NTSR1在GBM靶向治疗中可能发挥的作用。

1 材料与方法

1.1 材料收集2010～2017年陆军特色医疗中心/陆军军医大学大坪医院病理科存档的138例具有完整临床和病理资料的GBM，根据WHO(2016)中枢神经系统肿瘤分类，由高年资病理医师复核组织切片。本实验获陆军军医大学大坪医院伦理委员会批准(批准号2018-125)，所有患者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1临床资料收集 通过查阅住院病历及询问患者收集患者的临床资料，包括患者年龄、性别、病程、肿瘤发生部位、病变大小、主要症状、影像学特征、治疗方法、治疗效果和复发转移等，并进行追踪随访。随访开始以病例确诊之日起计算，按月记录。随访截止原因有：死亡、中途失访或随访截止(2019年6月)。

1.2.2组织芯片制备 选取肿瘤组织，HE切片由2名主治及以上职称医师分别评片，避开坏死及变性部位，选取肿瘤细胞富集区，并圈注；融蜡，制备空白蜡块；设计点位组织阵列；加载设计图标，启动组织芯片制作程序，将一个空白受体蜡块置于组织芯片仪1号位，其余按设计顺序从2～8依次放置并全部锁紧。对选择区域依次拍照，后通过调整取样针依次取出空白蜡，填加选取的肿瘤组织芯。最后将填好组织芯的受体蜡块放置于模具中，轻压蜡块使组织芯在模具中处于同一平面。将模具置于65 ℃组织芯片融合台上融合15 min，冷却后取下，常规切片，备用。

1.2.3免疫组化 采用免疫组化EnVision两步法染色，抗原标记NTSR1、CHI3L1购自Origen公司，IDH1R132H(H09)、ATRX、p53、Ki-67和CD44(DF1485)购自福州迈新公司，EGFR、PTEN、vimentin购自北京中杉金桥公司。结果判断以出现肿瘤细胞表达为阳性。NTSR1抗体以肺腺癌组织作为阳性对照，其余抗体设置相应阳性对照，以PBS(0.01 mol/L，pH 7.2)代替一抗作为空白对照。

1.2.4GBM分子分型 根据文献[7]报道的方法并加以优化，用于GBM分子分型：IDH1阳性，归为前神经元型；IDH1阴性，EGFR高表达，归为经典型；IDH1、EGFR阴性，2个以上间叶标志物高表达(PTEN、vimentin、CHI3L1、CD44)，归为间叶型；IDH1、EGFR和间叶标志物均阴性，归为其他/不能分类。

1.3 统计学分析采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。两组与多组间构成比比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。一致性检验(Kappa检验)分析不同蛋白表达的相关性。不同蛋白表达组患者的总生存采用Kaplan-Meier法，并用对数秩检验(Log-rank test)比较组间生存时间差异；单因素和多因素Cox生存回归分析与OS相关的预后因素。检验水准P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床特征138例GBM患者平均年龄61.4岁，中位年龄53岁；男性74例，女性64例，男女比为1.16 ∶1；幕上好发，幕下罕见，额叶、颞叶好发，约26.08%的患者累及2叶；以头昏头痛、呕吐等为主要症状，23.19%的患者复发，中位无进展生存期(progression free survival, PFS)为6.0个月，中位OS为9.0个月。

2.2 免疫表型及分子分型免疫组化显示ATRX阳性定位于细胞核，细胞核表达缺失提示ATRX突变(图1)，核阳性提示ATRX保留，肿瘤周围组织可见ATRX表达；IDH1阳性信号位于细胞质(图2)，提示为IDH1突变型GBM；瘤细胞胞质未见IDH1表达，提示为IDH1野生型GBM，肿瘤周围组织未见IDH1表达；p53表达定位于细胞核，弥漫表达提示p53阳性(图3)，散在强弱不等表达提示p53阴性(野生型)，肿瘤周围组织p53阴性。138例GBM中，IDH1阳性9例，ATRX缺失27例，p53阳性52例。

①②③④⑤⑥⑦⑧

EGFR阳性信号定位于细胞膜和高尔基体(图4)，CD44阳性信号定位于细胞膜和高尔基体(图5)，CHI3L1阳性信号位于细胞质和高尔基体(图6)。肿瘤周围组织EGFR、CD44、CHI3L1弱阳性。138例GBM中，IDH1阳性9例，EGFR弥漫阳性46例，CHI3L1阳性66例，根据IDH1、EGFR、CD44、CHI3L1表达结果，对138例GBM进行分子分型：间叶型66例(47.8%)，经典型46例(33.3%)，前神经元型9例(6.5%)，其他/不能分类17例(12.3%)，分型率为87.7%(121/138)。

2.3 NTSR1与GBM分子分型的关系免疫组化染色显示NTSR1阳性定位于细胞膜、细胞质(图7)，肿瘤周围组织中阴性(图8)。138例GBM中NTSR1阳性80例，NTSR1在GBM分子亚型中的表达差异有显著性(P=0.003，表1)，在经典型、间叶型、前神经元型和其他/不能确定类型的阳性率分别是67.4%、63.6%、11.1%和35.3%。

2.4 GBM中NTSR1与IDH1、ATRX、p53表达的相关性IDH1的阳性率为6.5%(9/138)，NTSR1在IDH1突变型GBM中阳性率为11.1%(1/9)，NTSR1在IDH1野生型GBM中的阳性率为62.0%(79/129)，NTSR1与IDH1表达呈负相关(P=0.001)；ATRX表达缺失率为19.6%(27/138)，ATRX表达(保留)率为80.4%(111/138)，NTSR1与ATRX表达呈正相关(P=0.043)；p53阳性率为37.7%(52/138)，NTSR1与p53表达无相关性(P=0.263，表1)。

表1 NTSR1与胶质母细胞瘤分子亚型、IDH1、ATRX、p53表达的关系

2.5 预后分析138例GBM预后分析结果显示：患者性别(Log-rank=0.050，P=0.823)、p53表达(Log-rank=2.815，P=0.093)与OS无相关性。患者年龄与OS有相关性(Log-rank=4.300，P=0.004)，患者年龄越大，死亡风险越高；治疗方式与OS有相关性(Log-rank=52.893，P<0.001)，采取手术治疗患者的中位OS为6个月，手术+放疗/化疗患者的中位OS是11个月，手术+化疗+放疗患者的中位OS是32个月(图9A)。上述结果提示，采取手术+放疗+化疗的治疗方式的患者预后最好。

此外，分子亚型与OS有相关性(Log-rank=9.971，P=0.019，图9B)，前神经元型、经典型、间叶型、其他/不能分类的中位OS分别是39、10、9、17个月。IDH1与OS有相关性(Log-rank=6.189，P=0.013)，IDH1突变型和IDH1野生型患者的中位OS分别是39、10个月(图9C)。ATRX与OS有相关性(Log-rank=5.130，P=0.024，表2)，ATRX缺失和阳性患者的中位OS分别是17.0和10.0个月。NTSR1阴性与阳性患者的中位OS分别为17个月和9个月，两组间OS差异有显著性(P=0.008，表2，图9D)。单因素Cox回归分析结果亦表明，NTSR1阳性患者较NTSR1阴性患者死亡风险显著增加；患者年龄(P=0.004)、治疗方式(P<0.001)和IDH1(P=0.022)、分子亚型(P=0.006)是预后相关因素(表3)。

表2 Kaplan-Meier生存曲线分析胶质母细胞瘤临床病理特征与预后的关系

多因素Cox回归分析结果显示：在年龄、性别、分子亚型、IDH1、ATRX、治疗方式评分中，只有分子亚型(前神经元型vs其他亚型)(P=0.008)、治疗方式(手术+放疗/化疗vs手术，手术+放疗+化疗vs手术，P<0.001)是OS的独立预后因素(表4)。

表4 多因素Cox回归分析

3 讨论

3.1 GBM临床特征本组中GBM男女比为1.16 ∶1，低于美国的1.60，接近于瑞士的1.28 ∶1[8]；中位OS为9.0个月，低于文献报道[8]，可能与47%患者仅接受手术治疗，缺乏辅助放疗与化疗有关。

3.2 GBM异质性与分子分型GBM是一种高度异质性的肿瘤，患者预后较差，从组织学到分子学均发现GBM肿瘤内和肿瘤间的异质性[9-10]。GBM具有不同组织病理亚型如上皮样胶质母细胞瘤及分子遗传学特征(IDH1、ATRX基因改变等)[11]，其IDH1突变、ATRX突变缺失、1p/19q共缺失、TERT基因启动子突变等与预后相关[12]。Verhaak等[13]将GBM分为4个基因亚型：间叶型、经典型、神经元型和前神经元型，每种类型以特定基因差异为特征，预后为前神经元型>神经元型>经典型>间叶型。尽管间叶型预后差，但其可能受益于免疫治疗。将GBM进行分子分型对指导临床预后有重要意义，最初的分子分型基于表达谱，其操作繁琐、费用高，不利于临床推广。本实验采用文献[7]报道的免疫组化法对GBM进行分子分型，将138例GBM中的121例GBM分为间叶型、经典型、前神经元型，中位OS分别是9.0、10.0、39.0个月。与文献报道的“不同分子分型对应不同预后”一致，这证实了基于IDH1、EGFR、PTEN、CD44、CHI3L1标记进行分子分型的有效性，适用于临床。对于不能分类的17例可进行测序或基因表达谱分析再进行分类。

ATRX、IDH1和TP53突变在星形细胞性胶质瘤谱系早期发展和进展中起重要作用，也与治疗和预后相关[14-16]。ATRX改变发生于绝大多数低级别星形细胞瘤和IDH1突变(继发性)的GBM。ATRX、p53、IDH这三种生物标志物单独或联合应用，可将GBM分为不同亚组，对成人GBM预后有很强的预测价值[14]。本实验结果证实GBM患者OS与GBM分子亚型、IDH1、ATRX相关，前神经元亚型较其他组预后好，IDH1突变、ATRX突变均提示患者预后好，但p53表达与预后无相关；分子亚型、治疗方式是GBM独立预后因素，前神经元亚型提示患者预后良好，手术完整切除+辅助放、化疗可明显改善患者预后，新近研究发现电场治疗可使患者的生存期延长至20个月[17]。另外，MGMT启动子甲基化也是预后良好的因素[18]。

近来研究显示，NTS/NTSR1在多种恶性肿瘤的发生、发展中扮演着重要角色。研究发现NTS及其受体NTSR1的表达与胶质瘤病理学分级呈正相关，通过数据库分析NTSR1是GBM患者预后的重要预测指标[6]。本实验采用免疫组化法检测NTSR1表达并分析NTSR1与OS的关系，证实NTSR1是GBM患者预后的重要预测指标，但并非独立预后因素；NTSR1表达是GBM预后差的因素。NTSR1在IDH1突变型GBM中表达率极低，提示NTSR1信号在IDH1突变型GBM中处于失活状态，突变的IDH1催化产生过量原癌代谢产物2-羟戊二酸，而非正常时的α-酮戊二酸，导致胶质瘤超甲基化表型[19]，IDH1突变型GBM超甲基化使NTSR1处于失活状态。文献报道NTSR1高甲基化水平提示结直肠癌患者预后好，NTSR1低甲基化水平有助于肿瘤恶性潜能[20]；有研究亦显示NTSR1启动子甲基化可调控NTSR1表达和沉默[21-22]。NTSR1主要表达于IDH野生型GBM，NTSR1表达与IDH野生型、ATRX(保留)呈正相关，两者均提示患者预后差。TP53体细胞突变在胶质瘤中发挥重要作用，特别是在低级别星形细胞瘤和IDH1突变型GBM。但本实验发现NTSR1表达与p53表达无关。

本实验发现，NTSR1在各分子亚型间表达差异有显著性，在经典型和间叶型中的阳性率明显高于前神经元型和其他类型，经典型和间叶型GBM较前神经元型GBM预后差，提示NTSR1阳性患者预后差可能与分子亚型有关。经典型GBM以EGFR高表达为特征，NTSR1在经典型GBM中的阳性率为67.4%。EGFR信号通路反式激活是NTS信号在肿瘤进展中重要下游事件[23]。NTS/NTSR1可激活EGFR、HER-2和HER-3[23-24]，NTS诱导EGFR过表达和激活[25]。NTS信号活化EGFR信号，诱导IL-8分泌，维持GSC“干样”特征[26]。作者推测在经典型GBM中NTSR1可能通过活化EGFR信号通路起作用。NTSR1在间叶型GBM中的阳性率为63.6%。研究发现NTS/NTSR1共表达通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进上皮-间质转换和促进肿瘤转移[4]。在间叶型GBM中NTSR1活化可能通过Wnt/β-catenin信号通路起作用，促进上皮-间质转换，促进肿瘤生长。

综上可知，NTSR1表达与GBM分子分型、重要分子标志IDH1、ATRX有相关性，NTSR1表达是患者预后差的因素之一。分子分型、治疗方式是GBM独立的预后因素。