胃癌组织中腺苷酸激酶4和HIF-1α的表达及其临床意义

夏 林，王劲松

胃癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，近年来随着胃镜技术的发展，胃癌的早期发现和诊断已有所提高，但晚期胃癌的发病率仍然较高。晚期胃癌的治疗主要是手术结合化疗及靶向治疗，但患者术后5年生存率较低，主要原因是肿瘤细胞发生了侵袭、转移。因此寻找和识别胃癌进展过程中参与的基因对于发现新的胃癌预后标志物和治疗靶点具有重要意义。腺苷酸激酶(adenylate kinase, AK)是一种丰富的核苷酸磷酸转移酶，其主要作用是通过将1个ATP或GTP分子中的1个磷酸基团转移到AMP上，催化产生2个ADP分子，从而平衡细胞腺嘌呤核苷酸组成以维持能量稳态[1]。AK4是AK家族的成员之一，最近研究发现肺腺癌中AK4阳性提示肺癌患者预后差，其可促进肺癌细胞的转移[2]。AK4在胃癌中的研究尚未见文献报道，本文应用免疫组化EnVision法检测胃癌组织中AK4和低氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)的表达，旨在探讨AK4在胃癌发生、发展中的作用及其与HIF-1α的关系，为胃癌的治疗寻找新的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集2015年1月～2017年12月江苏省扬中市人民医院存档的手术切除胃癌组织79例，其中男性49例，女性30例，患者年龄43～86岁，平均66.5岁，中位年龄67岁。所有患者术前均未行化疗或放疗，术后均有完整的病理诊断。79例胃癌分化程度：高分化6例，中分化37例，低分化36例；Lauren分型：肠型55例，弥漫型24例；肿瘤侵及肌层24例，侵及浆膜下及浆膜外者55例；有淋巴血管侵犯者33例，无淋巴血管侵犯者46例；有淋巴结转移者44例，无淋巴结转移者35例；pTNM分期中，Ⅰ期20例，Ⅱ期25例，Ⅲ期34例。取距离肿瘤>5 cm的癌旁正常胃黏膜组织作为正常对照。

1.2 试剂与方法鼠抗人AK4单克隆抗体(OTI3B1，LSbio公司，稀释比1 ∶150)购自珠海泉辉公司；兔抗人HIF-1α单克隆抗体(EP118，稀释比1 ∶100)与EnVision法检测试剂盒均购自北京中杉金桥生物公司。所有手术标本均经10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋，4 μm厚连续切片3张，分别行HE染色和免疫组化染色。免疫组化染色采用EnVision法，切片梯度乙醇脱蜡和水化后，高压锅高温高压进行抗原修复，然后滴加一抗，4 ℃冰箱内孵育过夜，次日依次滴加二抗，DAB显色，镜下控制反应时间，苏木精复染，中性树胶封固。用已知肺癌阳性组织作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3 结果判断AK4阳性定位于细胞质，呈颗粒状，HIF-1α阳性定位于细胞质。结果判断由两名病理医师采用双盲法判读，结果不一致者在多人共揽显微镜下达成意见一致。结果判断依据文献[3]，先根据染色强度分为：无染色为(-)，弱阳性为(1+)，中等阳性为(2+)，强阳性为(3+)；然后根据阳性细胞百分比为25%进一步分为2组，AK4和HIF-1α高表达定义为阳性细胞染色强度为(2+)或(3+)，且阳性细胞比例>25%。

1.4 统计学分析采用SPSS 23.0软件进行统计学分析，AK4和HIF-1α表达与胃癌临床病理参数之间的关系采用χ2检验及列联系数进行分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌及癌旁组织中AK4和HIF-1α的表达AK4阳性信号为颗粒状胞质阳性(图1、2)，HIF-1α阳性信号为胞质伴或不伴胞膜阳性(图3、4)。79例胃癌组织中AK4高表达率为73.4%(58/79)，高于癌旁正常组织(25.3%，20/79)，两组相比差异有统计学意义(χ2=36.563，P<0.01)。胃癌组织中HIF-1α的高表达率为69.6%(55/79)，高于癌旁正常组织(16.5%，13/79)，差异有统计学意义(χ2=45.541，P<0.01)。

①②③④

2.2 胃癌组织中AK4和HIF-1α高表达与临床病理特征的关系胃癌组织中AK4高表达率与淋巴结转移、脉管侵犯和临床分期密切相关，淋巴结阳性的胃癌组织AK4高表达率明显高于淋巴结阴性的胃癌组织，伴有脉管侵犯的胃癌组织中AK4高表达率高于无脉管侵犯者，临床分期Ⅲ+Ⅳ期胃癌组织AK4高表达率明显高于Ⅰ+Ⅱ期胃癌，差异均有统计学意义(P均<0.05，表1)。HIF-1α在胃癌组织中的表达与肿瘤Lauren分型、淋巴结转移及临床分期有关(P<0.05)，与患者性别、年龄、分化程度、浸润深度和脉管侵犯等无关(P>0.05，表1)。

表1 胃癌组织中AK4和HIF-1α高表达与临床病理特征之间的关系

2.3 胃癌组织中AK4和HIF-1α表达的相关性统计分析显示，胃癌组织中AK4和HIF-1α表达呈正相关(P<0.05，表2)。

表2 胃癌组织中AK4和HIF-1α表达的相关性

3 讨论

近年来随着内窥镜技术的进展，早期胃癌的检出率有所提高，且患者预后较好，但晚期胃癌患者目前尚缺乏有效的治疗方法，预后仍较差。研究发现恶性肿瘤的发生、发展不仅涉及到原癌基因的激活和抑癌基因的失活，还涉及到能量代谢相关的基因。AK是生物活细胞中参与高能量磷酸化转移反应的一种关键调节酶，在细胞的能量代谢中发挥重要作用[4]。目前研究发现AK有9种，不同类型AK在细胞内的定位不同，其中AK4定位于线粒体基质中[5]。位于线粒体基质中的AK4已被证明作为一种应激反应蛋白与线粒体ADP/ATP转位酶物理性结合以维持细胞存活[6]。有研究显示，沉默AK4表达可使细胞ATP水平提高到25%，同时增加ADP/ATP比例，活化AMPK信号，从而参与恶性肿瘤的发生、发展[7]。

本实验采用免疫组化法分析了胃癌及其癌旁正常组织中AK4的表达，结果显示AK4在癌组织中的高表达率明显高于癌旁正常组织，且胃癌组织中AK4高表达率与胃癌淋巴结转移、脉管侵犯和临床分期密切相关，提示AK4不仅可能参与了胃癌的发生，而且可能在胃癌的侵袭、转移过程中发挥重要作用。尽管AK4表达与胃癌的相关性国内外尚未见文献报道，但AK4在其他一些恶性肿瘤中的表达已有相关研究。Jan等[2]采用微阵列研究发现AK4在肺腺癌组织中表达上调，且AK4高表达与肿瘤分期晚、疾病复发和预后差有关，提示AK4促进了肺腺癌的恶性进展。庞亮等[8]研究了85例肌肉浸润性膀胱癌及对应癌旁组织中AK4的表达，结果显示AK4在癌组织中高表达，在癌旁组织中无表达，进一步分析膀胱癌组织中AK4表达与临床病理特征的关系，结果显示AK4高表达与膀胱癌远处转移和脉管内瘤栓密切相关，生存分析显示膀胱癌中AK4高表达患者的生存时间明显低于低表达者。李辰运等[9]研究发现，胰腺癌组织中AK4的表达高于对应癌旁组织，且AK4表达与胰腺癌肿瘤分期、淋巴结转移、神经侵犯和脉管内瘤栓相关。综合文献报道与本组实验结果，提示AK4高表达可能参与多种恶性肿瘤的发生、发展。

缺氧是实体性恶性肿瘤的重要特征。研究发现低氧环境可增强癌细胞的侵袭能力，增加肿瘤细胞对放、化疗的抵抗，使肿瘤细胞更易发生侵袭和转移。HIF-1α是目前发现的一种介导细胞低氧反应中关键的转录抑制因子，其在常氧状态下容易被细胞内蛋白酶体系泛素化降解，缺氧时在细胞内聚集，通过正性调节细胞生存、增加新生血管数量及肿瘤细胞糖酵解，从而促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移[10]。研究发现HIF-1α在多种肿瘤中均过表达，朱园园等[11]研究发现子宫内膜腺癌中HIF-1α表达与肿瘤临床分期、组织学分级、肌层浸润和淋巴结转移有关。在胃癌研究中，倪小晴等[12]研究发现HIF-1α在胃癌组织中的表达高于正常组织，且HIF-1α表达与胃癌分化程度、浸润深度、淋巴结转移和TNM分期相关。崔立娟等[13]研究发现肿瘤直径≥3 cm、中低分化腺癌、Ⅲ+Ⅳ期及有淋巴结转移的胃癌组织高表达HIF-1α。本组实验结果显示，胃癌组织中HIF-1α的表达高于癌旁正常组织，且与胃癌Lauren分型、淋巴结转移及临床分期有关，与患者性别、年龄、分化程度、浸润深度和脉管侵犯等无关，与文献报道相符[14]。提示HIF-1α参与胃癌的发生、发展，并可作为预测胃癌侵袭性生物性行为的一种标志物。

Jan等[3]研究发现肺癌组织中AK4和HIF-1α表达呈正相关，且两者结合可预测肺癌患者更差的存活率，同时分子生物学研究亦发现AK4过表达可通过增加细胞内ROS水平来提高HIF-1α表达，随后在低氧条件下诱导肿瘤上皮-间质转化而促进肺癌的进展。本实验分析了胃癌组织中AK4和HIF-1α的相互关系，结果显示两者在胃癌中的表达呈正相关，提示AK4可能通过调控HIF-1α而促进胃癌的发生、发展，但具体的机制尚需要更进一步进行研究。

总之，本组实验结果显示，AK4可能通过调控HIF-1α参与了胃癌的发生、发展，检测胃癌组织中AK4和HIF-1α的表达可有助于评估胃癌的生物学行为和患者预后，并可能为胃癌的治疗提供一个基因靶点，但具体的机制尚需要进行深入的分子生物学研究。