弥漫大B细胞淋巴瘤中Wnt通路相关蛋白的表达及预后危险因素分析

赵东陆，邢 琦，宋 航

弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL)是临床上常见的造血系统恶性肿瘤之一，具有侵袭性高、转移迅速等特点[1]。Wnt信号通路在肿瘤细胞增殖及恶性转化过程中发挥重要作用。NKD1和β-catenin作为Wnt信号通路活化的关键因子，其异常表达与肿瘤进展密切相关[2]。Cyclin D1是Wnt通路的下游靶基因，Cyclin D1高表达可促进癌细胞的增殖和迁移[3]。本实验拟分析NKD1、β-catenin和Cyclin D1在DLBCL中的表达，并探讨三者表达与DLBCL临床病理特征的关系及预后评估的应用价值。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集2010年3月～2016年2月黑龙江省哈尔滨市第一医院收治的80例经病理学证实的DLBCL组织标本。所有入选患者在术前均未行放、化疗和其他治疗，且3年随访资料完整。根据中心母细胞数量确定FL分级，所有患者均为FL3级。80例DLBCL按照Ann Arbor分期标准[4]：Ⅰ+Ⅱ期39例，Ⅲ+Ⅳ期41例；参照Hans免疫亚型分类标准：生发中心B细胞(GCB)亚型38例，非生发中心(non-GCB)亚型42例；按国际预后指数(IPI)评分：0～2分(中低危组)35例，3～5分(中高危组)45例；根据发病部分是否侵犯结外器官分为：淋巴结内45例，侵犯结外器官35例。另选取同期淋巴结良性增生组织45例。DLBCL患者术后接受R-CHOP标准方案治疗，并均以电话、门诊等方式进行随访3年，记录患者总生存期(overall survival, OS)，OS定义为自确诊后至随访结束或死亡时间。

1.2 方法所有标本均经10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋、脱水、脱蜡、水化、抗原修复、滴加抗体、DAB显色、复染、封固。免疫组化染色采用SP法，试剂盒购自美国Abcam公司。兔抗人NKD1单克隆抗体、羊抗人β-catenin单克隆抗体和Cyclin D1单克隆抗体均购自北京奥维亚生物公司。DAB显色试剂盒购自美国Sigma公司。

1.3 判断标准镜下观察制备好的切片，以细胞内出现棕黄色颗粒为阳性。由2名病理科医师采用双盲法独立进行评估，每张切片随机选取5个高倍镜视野(400×)，每个视野内计数100个细胞中阳性细胞数，并求出平均值作为该患者的阳性细胞数。将所有患者阳性细胞数的平均值作为阈值，大于该阈值为阳性，反之则为阴性。

1.4 数据库在线分析采用基因表达谱数据动态GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)分析NKD1、β-catenin、Cyclin D1在DLBCL中的表达(数据来源于HiSeq RNA-Illumina HiSeq 2000 RNA Sequencing平台)，重点分析TCGA数据库和GTEx项目来源的47例DLBCL和337例正常组织中NKD1、β-catenin、Cyclin D1表达。

1.5 统计学分析采用SPSS 16.0软件进行统计学分析，分类资料用百分比表示，采用χ2检验进行分析；等级变量之间的相关性采用Spearman相关性分析；生存分析应用Kaplan-Meier方法，应用Cox回归分析预后影响因素，以双侧检验P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同组织中NKD1、β-catenin、Cyclin D1的表达3种蛋白在不同组织中均呈弥漫性分布，NKD1、β-catenin、Cyclin D1蛋白阳性淋巴细胞数分别为(18.93±3.48)、(29.78±5.39)、(32.38±6.47)个，以上述各组结果为阈值作为判定阳性细胞的标准。

NKD1在DLBCL组织中的阳性率为18.75%，明显低于淋巴结良性增生组织(75.56%)，差异有统计学意义(P<0.05)；β-catenin和Cyclin D1在DLBCL组织中的阳性率分别为78.75%、72.50%，均明显高于淋巴结良性增生组织(均为0)，差异有统计学意义(P<0.0.5，表1，图1、2)。

表1 不同组织中NKD1、β-catenin、Cyclin D1的表达[n(%)]

①A①B①C②A②B②C

2.2 GEPIA数据库分析NKD1、β-catenin、Cyclin D1表达GEPIA分析TCGA数据库和GTEx项目来源的数据发现，DLBCL组织中的NKD1水平低于正常组织，β-catenin和Cyclin D1水平均高于正常组织(P<0.05，图3)。

图3 NKD1、β-catenin、Cyclin D1在弥漫大B细胞淋巴瘤组织和正常组织中的表达：A.NKD1；B.β-catenin；C.Cyclin D1

2.3 NKD1、β-catenin、Cyclin D1表达与DLBCL临床病理特征的关系NKD1、β-catenin、Cyclin D1蛋白在DLBCL不同IPI评分、Ann Arbor分期中的表达差异均有统计学意义(P<0.05)；在不同患者性别、年龄、结构部位的表达差异无统计学意义(P>0.05)。在不同病理分型中NKD1蛋白表达差异有统计学意义(P<0.05)，而β-catenin和Cyclin D1蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05，表2)。

表2 弥漫大B细胞淋巴瘤中NKD1、β-catenin、Cyclin D1表达与临床病理特征的关系[n(%)]

2.4 DLBCL组织中NKD1、β-catenin、Cyclin D1表达的相关性Spearman相关性分析显示，DLBCL组织中，Cyclin D1和β-catenin的表达呈明显正相关(r=0.656，P<0.01)，NKD1和β-catenin与Cyclin D1的表达均呈明显负相关(r=-0.562，r=-0.536，P均<0.01，图4)。

图4 弥漫大B细胞淋巴瘤组织中NKD1、β-catenin、Cyclin D1表达的相关性分析：A.NKD1和β-catenin；B.NKD1和Cyclin D1；C.β-catenin和Cyclin D1

*P<0.05

2.5 NKD1、β-catenin、Cyclin D1表达与DLBCL患者生存分析80例DLBCL患者随访3年，死亡18例，3年生存率为77.50%(62/80)。DLBCL组织中NKD1阳性患者的3年生存率高于阴性者，差异有统计学意义(P<0.05)，而β-catenin和Cyclin D1阳性患者的3年生存率低于阴性者，但差异无统计学意义(P>0.05，图5)。

图5 NKD1、β-catenin、Cyclin D1表达与弥漫大B细胞淋巴瘤患者生存分析：A.NKD1；B.β-catenin；C.Cyclin D1

2.6 Cox多因素回归分析DLBCL患者的预后采用Cox回归分析临床病理因素、NKD1、β-catenin与Cyclin D1表达对DLBCL临床预后的影响。结果显示：患者性别、年龄、病理分型、结构部位与DLBCL患者的OS无相关性(P>0.05)；IPI评分(>2分)、Ann Arbor分期(Ⅲ+Ⅳ期)及β-catenin、Cyclin D1蛋白阳性是影响DLBCL预后的风险因素(P<0.05)，NKD1蛋白阳性是保护因素(表3)。

表3 Cox多因素回归分析弥漫大B细胞淋巴瘤患者的预后

3 讨论

KD1是Wnt信号通路的负向调节因子，可通过与散乱蛋白家族成员的特定编码区结合，降低蛋白表达量，从而对Wnt通路的活化起抑制作用[5]。研究发现[6]，在多种正常或良性病变组织中NKD1均阳性。而傅祥炜等[7]通过qRT-PCR法检测发现，在结直肠癌组织中mNKD1表达量上调。Flanagan等[8]研究结果显示，NKD1在82.9%的胃癌组织中表达缺失。本组实验结果显示，NKD1在DLBCL组织中的表达明显低于良性病变组织，且在不同病理分型中NKD1表达差异显著。上述结果提示NKD1参与肿瘤发展过程中信号通路构建的复杂性。Ann Arbor分期、IPI评分是评估DLBCL恶性程度的重要指标，进一步分析显示DLBCL组织中NKD1表达缺失随着Ann Arbor分期及IPI评分升高而增加，说明NKD1低表达能够间接反映DLBCL恶性生物学行为。

β-catenin可通过与细胞膜上的E-cadherin结合，调控癌细胞的侵袭和迁移能力[9]。但由于β-catenin对癌细胞恶性生物学行为的双重调控作用，目前已作为靶点成为肿瘤治疗的研究热点。β-catenin在T淋巴母细胞淋巴瘤早期已呈异常表达，并且与肿瘤分期和不良预后存在相关性[10]。本实验发现DLBCL组织中β-catenin的阳性率高于良性病变组织，说明β-catenin可能参与DLBCL的发生、发展。本实验结果显示，在DLBCL不同Ann Arbor分期及IPI评分组中β-catenin表达存在明显差异，提示β-catenin高表达和DLBCL的生物学行为存在关系。

Cyclin D1是Wnt通路下游的重要靶基因，当通路活性的异常改变，β-catenin在胞内聚集，Cyclin D1转录便被激活，这是肿瘤发生的重要机制[11]。研究显示[12]，Cyclin D1在乳腺癌组织中的表达明显高于其癌旁正常组织，进一步研究显示，Cyclin D1过表达可促进乳腺癌细胞的增殖和迁移。本实验结果显示，Cyclin D1在良性病变组织中表达缺失，而在DLBCL组织中的阳性率为72.5%，且与IPI评分和Ann Arbor分期密切相关，说明Cyclin D1蛋白是DLBCL的相关蛋白。

作为Wnt信号通路相关蛋白，Pearson相关性分析显示，DLBCL组织中NKD1、β-catenin、Cyclin D1相互之间均具有相关性，其中NKD1、β-catenin间呈正相关，且均与Cyclin D1表达呈负相关。通过进一步生存分析显示，NKD1、β-catenin、Cyclin D1表达与患者的OS均相关，本实验采用Cox多因素回归分析，提示NKD1、β-catenin低表达或Cyclin D1高表达会导致DLBCL患者较差的预后。

综上，NKD1、β-catenin在DLBCL中低表达，Cyclin D1呈高表达，三者可作为DLBCL患者预后独立预测因素。此外，NKD1、β-catenin和Cyclin D1与DLBCL的生物学行为有关，有望成为DLBCL治疗的潜在靶点。