肿瘤出芽与pT1期胃腺癌临床病理特征的相关性分析

徐 程，张 响，姬东泽，吴 靓，徐刘洋，张智弘

近年来对肿瘤的分子遗传学研究日益精进，但组织病理学形态在判断肿瘤性质、分化程度及评估患者预后方面仍有不可替代的作用。多项研究证实，肿瘤出芽(tumor budding, TB)是结直肠癌的不良预后因素，第8版AJCC指南、美国病理学家协会(College of American Pathologists, CAP)报告模板也提出，需在常规病理诊断中，对所有Ⅰ、Ⅱ期结直肠癌评估TB，评估方法及标准参照2016年国际TB会议共识(International Tumor Budding Consensus Conference, ITBCC)。然而，TB并非结直肠癌中的特有现象，其普遍存在于各种消化系统恶性肿瘤中，关于TB在胃癌(尤其是早期胃癌)中的意义尚不明确，本文收集232例pT1期胃癌，分析TB与其临床病理特征的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料收集2013年1月～2015年1月江苏省人民医院/南京医科大学第一附属医院病理学部明确诊断的pT1期胃腺癌(即肿瘤位于黏膜及黏膜下层)根治标本合计293例，剔除其中的低黏附性癌61例，最终纳入研究的pT1期胃腺癌合计232例，所有病例均具有完整的临床病理资料，包括患者性别、年龄、肿瘤最大径、肿瘤分化、肿瘤浸润层次、有无淋巴结转移(入组要求取材淋巴结个数均在15枚以上)、有无脉管内癌栓，所有病例术前均未行放、化疗或其他针对肿瘤的治疗。所有标本均经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，4 μm厚切片，由两名病理医师独立复习所有HE切片。通过电话或门诊病历系统对患者进行随访，本实验观察的预后指标为无进展生存时间(progression free survival, PFS)，即患者从手术日到出现复发、转移、死亡的生存时间。

1.2 TB评估方法目前胃癌中TB尚无规范化的评估方法，本实验基于ITBCC推荐的结直肠癌TB评估法评估胃癌TB，步骤如下：(1)根据目镜的直径计算该显微镜200倍视野的面积(本显微镜目镜直径22 mm，200倍视野直径1.10 mm，面积0.95 mm2)。(2)从癌组织的所有HE切片中，选取在肿瘤浸润前沿TB最丰富的一张切片；在100倍镜下观察该切片，寻找TB的热点区(至少观察10个100倍视野)。(3)选定热点区后，转到200倍视野，计数200倍视野下的TB数量。(4)根据不同显微镜直径，计算每0.785 mm2的TB数，即TB数=不同目镜实测TB数量/标化值(注：目镜直径20 mm的显微镜，200倍视野面积为0.785 mm2，其标化值为1，则本实验选用显微镜标化值为1.210)。(5)将每0.785 mm2的TB数<5个定义为低级别TB，每0.785 mm2的TB数≥5个定义为高级别TB。

1.3 统计学分析采用SPSS 23.0软件进行统计学分析。本实验中患者年龄、肿瘤最大径以中位数作为临界值进行分组，TB与胃腺癌临床病理特征的相关性分析采用Spearman秩相关性检验，多因素分析采用Logistic回归，生存分析采用Kaplan-Meier函数，Log-rank检验；P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床特征232例pT1期非低黏附性胃腺癌中，女性59例，男性173例；患者年龄33～86岁，中位年龄62岁；肿瘤最大径0.3～6 cm，中位值2.0 cm；高分化19例，中分化143例，低分化70例；浸润层次：黏膜内(pT1a)116例，黏膜下(pT1b)116例；无淋巴结转移202例，有淋巴结转移30例；无脉管内癌栓209例，有脉管内癌栓23例。16例患者术后接受化疗(均为有淋巴结转移的病例)，其余患者术后均未行化疗。

2.2 TB的评估第一次阅片后，66例TB分级不确定，经重新切片及讨论后再次阅片评估得出最终结果：232例pT1期非低黏附性胃腺癌中，低级别TB 196例(84.5%)(图1)，高级别TB 36例(15.5%)(图2)。

①②

2.3 TB与胃腺癌临床病理特征的相关性高级别TB与女性患者(女性vs男性，r=-0.160，P=0.015)、肿瘤低分化(高+中分化vs低分化，r=0.263，P<0.001)、肿瘤浸润至黏膜下层(黏膜内vs黏膜下，r=0.381，P<0.001)、有淋巴结转移(无淋巴结转移vs有淋巴结转移，r=0.403，P<0.001)、有脉管内癌栓(无脉管内癌栓vs有脉管内癌栓，r=0.376，P<0.001)相关，与患者年龄、肿瘤最大径无相关性(表1)。

表1 TB与胃腺癌临床病理特征的相关性[n(%)]

2.4 TB与胃腺癌临床病理特征的多因素分析将性别、肿瘤分化、肿瘤浸润层次、有无淋巴结转移、有无脉管内癌栓纳入pT1期胃腺癌TB的多因素分析，结果显示：肿瘤浸润至黏膜下层(OR=17.192，P<0.001)、有淋巴结转移(OR=3.976，P=0.011)、有脉管内癌栓(OR=3.521，P=0.033)是高级别TB的独立危险因素，而性别、肿瘤分化非独立危险因素(表2)。

表2 高级别TB(TB≥5)与胃腺癌临床病理特征的多因素分析

2.5 淋巴结转移与胃腺癌临床病理特征的相关性淋巴结转移与女性患者(女性vs男性，r=-0.306，P<0.001)、肿瘤低分化(高+中分化vs低分化，r=0.278，P<0.001)、肿瘤浸润至黏膜下层(黏膜内vs黏膜下，r=0.206，P=0.002)、有脉管内癌栓(无脉管内癌栓vs有脉管内癌栓，r=0.302，P<0.001)、高级别TB(低级别vs高级别，r=0.403，P<0.001)相关，与患者年龄、肿瘤最大径无明显相关性(表3)。

表3 淋巴结转移与胃腺癌临床病理特征的相关性[n(%)]

2.6 淋巴结转移与胃腺癌临床病理特征的多因素分析将患者性别、肿瘤分化、肿瘤浸润层次、有无脉管内癌栓、TB分级纳入pT1期胃腺癌淋巴结转移的多因素分析，结果显示：女性(OR=0.138，P<0.001)，肿瘤低分化(OR=2.783，P=0.036)、高级别TB(OR=3.876，P=0.014)是淋巴结转移的独立危险因素，浸润至黏膜下层和有脉管内癌栓非独立危险因素(表4)。

表4 淋巴结转移与胃腺癌临床病理特征的多因素分析

2.7 生存分析本组177例患者获得随访资料，随访时间7～85个月(中位随访时间69个月)，20例患者疾病发生进展(11.3%)，包括16例患者因肿瘤死亡，4例患者出现复发或转移但目前尚存活，157例患者无进展生存(88.7%)。生存分析显示，TB与pT1期胃腺癌患者的无进展生存期无明显相关性(P>0.05)。

3 讨论

TB定义为肿瘤间质内散在的单个或≤4个成簇的肿瘤细胞，广义的TB分为肿瘤周围出芽(peritumoral budding, PTB)和肿瘤内出芽(intratumoral budding, ITB)，PTB是指在肿瘤的浸润前沿出现的TB，只能在手术标本中评估，ITB是指在肿瘤主体内出现的TB，在手术标本、活检标本中均可评估[1]。尽管ITB在肿瘤的预后评估中有一定的价值，比如部分学者认为ITB与结直肠癌淋巴结转移相关[2]，但目前国际上主流的研究认为，ITB提示不良预后的证据等级不如PTB充分，ITBCC目前尚不建议将ITB纳入消化系统肿瘤的组织病理学评估中。大部分文献报道的TB(包括本实验)均特指PTB。

TB最早被发现与结直肠癌的侵袭、转移密切相关：多个中心的研究均证实TB是pT1期结直肠癌淋巴结转移的独立相关因素[3-4]，最大样本量的研究来自2015年日本Kawachi等[5]的研究，806例pT1期结直肠癌中，有233例存在高级别TB(29%)，25%高级别TB病例发生淋巴结转移，仅7%低级别TB病例发生淋巴结转移(P<0.001)。TB是Ⅱ期结直肠癌无进展生存期和总生存期的独立预后因子。一个纳入12项评估TB作为Ⅱ期结直肠癌预后因素的研究系统证明，高级别TB是重要的不良预后因素(P<0.001)，并可以作为病死率的独立预测因子(P<0.001)[6]。基于TB对提示患者预后的重要价值，结直肠癌的CAP病理报告模板中，已将TB作为常规报告内容。

除了结直肠癌，越来越多的研究认为TB与胃癌、食管癌、胰腺癌等多种消化系统肿瘤的预后相关[3, 7-8]。在本实验之前，针对胃癌TB的系统性研究主要有4项[9-12]，均认为高级别TB的病例具有更高的侵袭性(表5)。本组实验结果显示，高级别TB与更深的肿瘤浸润层次、淋巴结转移、脉管内癌栓相关，而这些病理参数均提示肿瘤的侵袭性和不良转归，与文献报道相似。其中TB与淋巴结转移的相关性尤其值得关注，对于内镜下黏膜剥除术的早期胃癌标本，我们不仅要关注肿瘤距垂直切缘的距离，还应评估TB，从而预测其淋巴结转移风险，成为是否需追加根治手术的重要依据。

表5 胃腺癌中TB的分析

Che等[9]、Olsen等[10]、Kemi等[11]在全部胃腺癌中的TB研究均显示，高级别TB与较短的生存期相关，仅Gulluoglu等[12]的研究针对pT1期胃腺癌，但未做生存分析。本实验预后分析结果显示，TB与pT1期胃腺癌患者的无进展生存期无显著相关性，其原因可能是高级别TB与淋巴结转移显著相关，而有淋巴结转移的部分患者术后接受了化疗，改善了预后，作者猜想，TB可协同淋巴结转移，成为早期胃癌患者术后是否需要化疗的参考依据。本组部分病例因失访，可能干扰了生存分析结果，故pT1期胃腺癌中TB与预后的相关性需加大样本量进行深入探究。

目前胃癌中的TB研究尚不如结肠癌深入，且无规范化的TB评估方法，以往的4项研究评估方法也各不相同，导致TB低级别、高级别的分级标准也未统一。本实验与Kemi等[11]的研究参考了ITBCC推荐的结直肠癌“TB热点区”评估法，即从所有切片中选取1个最热点区域，计数该区域200倍视野下的TB数，该方法已形成共识，且相对简单，不会给诊断工作造成负担，建议推广到胃癌的TB评估中。ITBCC比较了在HE切片中直接观察和利用上皮免疫组化标记观察TB，发现两种方法对TB的判读结果相似，且前者更加方便、经济，也避免了上皮标记在坏死细胞中出现假阳性现象，故推荐病理医师利用HE切片直接评估TB，但报告结果完全依赖于观察者的经验，需经过统一培训来保证判读的可重复性。

本组病例未将低黏附性癌纳入其中，因为Olsen等[10]和Kemi等[11]的两项研究均不推荐在低黏附性癌中评估TB，他们认为，低黏附性癌以单个散在肿瘤细胞的形式浸润胃壁，难以明确何为肿瘤浸润前缘，故无法准确评估TB，有学者认为，低黏附性癌可能是高级别TB的一种极端表现形式，即肿瘤完全由出芽的肿瘤细胞构成[3]，也可解释为何低黏附性癌的侵袭性更强、预后更差。另外，目前对于其他一些特殊组织学亚型腺癌中TB的评估经验有限，需十分谨慎，如在黏液腺癌中，漂浮在黏液湖里的肿瘤细胞簇不应视为TB；若肿瘤间质弥漫性炎细胞浸润及促结缔组织反应(尤其是在髓样癌中)，有时很难观察到其中的TB，此时可通过重新切片或上皮免疫组化标记辅助评估；新辅助化疗后的标本不适合评估TB，故“TB无法评估”，并作出相应解释，在病理诊断中可以接受[1]。

TB与上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)相关[13]：EMT是指上皮细胞转化为梭形间质细胞的过程，是胚胎发育和伤口愈合所涉及的正常生理机制，过程中伴随着上皮细胞间黏附蛋白的减少、并获得促进细胞迁移的间叶表型[14]。在出芽的肿瘤细胞中，与细胞黏附能力相关的钙黏蛋白E-cadherin、claudins、α-catenin、β-catenin等表达下调，而诱导EMT过程的重要间叶标记ZEB1、ZEB2、β-catenin、vimentin、SMA等显著上调[13]。目前研究认为，TB模仿了EMT过程，使肿瘤获得侵袭、转移能力，从而解释了高级别TB病例更易发生淋巴结转移、预后也更差的原因。临床工作中，可应用于证实TB的免疫标志物较少，目前获得普遍认可且特异性较强的是E-cadherin膜阳性水平下调，β-catenin在肿瘤主体内呈细胞膜、质阳性，在浸润前沿(即出芽的肿瘤细胞)中呈细胞核阳性。目前，通过阻断EMT相关信号转导通路中的各种受体(Axl、c-MET等)、酶(COX2、Erk2等)、转运蛋白(LIV-1等)，研发出许多相关抑制剂，在抑制肿瘤的转移、进展方面取得一定的治疗效果[15]。而TB与EMT密切相关，提示EMT相关抑制剂可成为高级别TB病例的潜在治疗靶点。

综上所述，TB与pT1期非低黏附性胃腺癌淋巴结转移、脉管内癌栓、浸润层次显著相关，是肿瘤侵袭性的重要指标；TB的评估方法建议采用ITBCC推荐的结直肠癌“TB热点区评估法”；基于其重要的临床病理价值，建议将其推广到pT1期胃腺癌的常规诊断体系中。