黏液性与非黏液性结直肠腺癌中PD-L1、CD8的表达

李贵兰，陆丽平，饶晓松

结直肠癌的发病率、病死率均较高，腺癌是其常见类型，根据其组织病理学特点可将腺癌分为多种亚型，其中黏液性结直肠腺癌(mucinous colorectal adenocarcinoma, MCA)占结直肠腺癌的15%～20%，与非黏液性结直肠腺癌(non-mucinous colorectal adenocarcinoma, non-MCA)相比，MCA分化程度低且恶性度高，MCA患者常表现较高的转移风险，手术和化疗后效果不佳，预后较差[1]。近年免疫检查抑制剂在癌症免疫疗法中备受关注，应用程序性死亡蛋白-1(programmed death protein-1, PD-1)或程序性死亡蛋白-配体1(programmed death protein-ligand 1, PD-L1)抑制剂的免疫疗法已成为治疗恶性肿瘤的有效手段，如非小细胞肺癌、肾细胞癌、黑色素瘤等[2-5]。在恶性肿瘤组织中PD-L1通过结合T细胞上的PD-1能抑制宿主T细胞对肿瘤组织的免疫反应[4-5]。PD-L1发挥作用与T细胞密切相关，特别是抗肿瘤CD8+T细胞，PD-L1阳性肿瘤细胞和CD8+T细胞是新辅助化疗治疗局部晚期直肠癌患者预后的关键标志物[6]。本文应用免疫组化法检测MCA和non-MCA中PD-L1和CD8的表达，探讨两者之间是否存在差异，以期为临床免疫疗法提供线索。

1 材料与方法

1.1 材料收集2017年1月～2020年6月北京大学国际医院接受手术治疗的结直肠癌患者106例，其中non-MCA 90例，MCA 16例，所有患者无免疫系统疾病，未合并其他肿瘤，术前均未接受治疗。查阅患者临床病理资料，男性68例，女性38例，年龄40～80岁，≤50岁者35例，>50岁者71例。

1.2 免疫组化鼠抗人PD-L1购自Gene Tech公司，鼠抗人MLH1购自徕卡公司，鼠抗人CD8、MSH2、MSH6、PMS2均购自北京中杉金桥公司，阿辛蓝/PAS染色试剂盒购自珠海贝索生物公司。应用徕卡全自动免疫组化仪(BOND-MAX，徕卡公司，德国)进行PD-L1、CD8、MLH1、MSH2、MSH6和PMS2染色，免疫组化染色采用EnVision两步法。

1.3 结果判定本组分别评估肿瘤细胞与肿瘤间质中PD-L1的免疫组化染色结果，肿瘤细胞阳性标准为仅有细胞膜染色(无论完整与否以及染色强度)。肿瘤间质免疫细胞(淋巴细胞、巨噬细胞和树突细胞)的细胞膜或细胞质着色均判为阳性：PD-L1阳性细胞≥5%为阳性[7]。计算肿瘤组织中PD-L1阳性率的均数，高于均数为高表达，低于均数为低表达。200倍视野下随机选取5个10 000 μm2肿瘤间质中CD8+T细胞的数量，计算其均数，即代表为该肿瘤组织中CD8+T细胞的表达量，再计算肿瘤组织中CD8+T细胞数量的均数，高于均数为CD8高表达，低于均数为低表达。检测肿瘤错配修复系统蛋白MLH1、MSH2、MSH6、PMS2的表达，其中≥1项阴性则判定肿瘤为微卫星不稳定(microsatellite instability, MSI)，而MLH1、MSH2、MSH6、PMS2均阳性则判定为微卫星稳定(microsatellite stability, MSS)。

2 结果

2.1 MCA与non-MCA组织学特征MCA表现为肠壁内不规则腺体浸润，腺腔内外充满黏液，肿瘤细胞核大深染，异型性明显；non-MCA表现为肠壁内不规则腺体浸润，腺腔内无或含少量黏液，间质炎细胞弥漫浸润，肿瘤细胞核大，空泡状，核仁明显，可见核分裂象(图1、2)。MCA组与non-MCA组相比，其内含大量黏液，占肿瘤组织面积的50%以上(图3、4)。

①②③④⑤⑥⑦A⑦B

2.2 MCA与non-MCA组织中PD-L1的表达两组肿瘤组织中PD-L1多表达于肿瘤间质的免疫细胞(图5、6)。本组仅7例肿瘤组织的癌细胞中有PD-L1表达，占总标本的6.6%，且在肿瘤细胞中占比较小(<1%肿瘤细胞)，肿瘤细胞呈乳头状生长，间质血管丰富，扩张充血，肿瘤细胞呈假复层结构排列，核呈长椭圆形，空泡状，核仁明显，胞质粉染(图7)。本组non-MCA组织中PD-L1表达高于MCA，差异有统计学意义(P<0.001，图8)。

图8 黏液性结直肠腺癌(MCA)与非黏液性结直肠腺癌(non-MCA)组织中PD-L1的表达

2.3 MCA与non-MCA组织中CD8+T细胞的表达免疫组化结果显示，在non-MCA组织中23%的PD-L1和CD8同时高表达，48%的PD-L1和CD8同时低表达，7%的PD-L1高表达和CD8低表达，22%的PD-L1低表达和CD8高表达。在MCA组织中有40%的PD-L1和CD8同时低表达，60%的PD-L1低表达而CD8高表达。

2.4 MCA与non-MCA组织中CD8+T细胞的表达本组non-MCA组织的单位面积肿瘤间质中CD8+T细胞数量为15.3，MCA组织为9.2，尽管non-MCA组CD8+T细胞数量的绝对值高于MCA组，但两者差异无统计学意义(图9)。

图9 黏液性结直肠腺癌(MCA)与非黏液性结直肠腺癌(non-MCA)组织中CD8+ T细胞的表达

2.5 MCA与non-MCA组织中的MSI和MSS本组实验结果显示，PD-L1阳性的non-MCA中有11%为MSI，89%为MSS；PD-L1阳性的MCA中有14%为MSI，86%为MSS。另外，本组还分析PD-L1阳性的结直肠腺癌的发生部位，其中50%为直肠，25%为乙状结肠，13%为升结肠，4%为横结肠，5%为降结肠，3%为全结肠。

3 讨论

结直肠癌为消化道常见的恶性肿瘤，其发病率与病死率较高[1,8]。MCA作为结直肠腺癌的亚型之一，与non-MCA相比，具有分化程度低，恶性度高，易转移，手术和化疗后的治疗效果不理想，预后较差等特点[1]。研究MCA与non-MCA分子表型差异，将为结直肠腺癌的治疗及预后评估等提供线索。目前手术、化疗和放疗是治疗结直肠癌的主要方法。近年肿瘤微环境越来越受重视，研究肿瘤细胞和免疫微环境之间的关系越来越受到关注。应用免疫检查点抑制剂调节免疫功能逐渐成为一种新兴的治疗方法[2,9]，该疗法被应用于晚期肿瘤患者、肿瘤发生转移患者以及不适合一线多药物化疗的患者[9]。文献报道PD-L1阳性的肿瘤对于抗PD-1/PD-L1治疗表现出更强的敏感性，且疗效更好，提示检测肿瘤组织中PD-L1的表达对于预测免疫治疗效果有一定的价值[2,9-11]。本组实验探讨MCA和non-MCA的肿瘤细胞及间质中相关免疫细胞PD-L1的表达及差异，结果显示：不同于非小细胞肺癌及肾细胞癌等，结直肠腺癌中PD-L1主要表达于肿瘤间质的免疫细胞，且non-MCA组织中PD-L1表达比MCA高。结合文献和本组实验结果，表明non-MCA患者应用PD-L1/PD-1抑制剂的效果可能优于MCA患者，但实际临床效果需进一步验证。另外，在肺癌和卵巢癌中亦发现，黏液性肺癌和黏液性卵巢癌中PD-L1表达比非黏液性肺癌和卵巢癌低[12-13]。

有研究发现，在肿瘤细胞表面PD-L1表达缺失，而肿瘤间质细胞表达PD-L1的小鼠中，应用PD-L1/PD-1抑制剂依然能抑制肿瘤的免疫逃逸反应，提示肿瘤间质细胞表达PD-L1在肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用[14]。有研究表明巨噬细胞可通过表达PD-L1与T淋巴细胞表面PD-1结合，抑制T淋巴细胞增殖和活化，并诱导效应T细胞凋亡，导致T淋巴细胞对肿瘤细胞杀伤作用下降，引起肿瘤细胞免疫逃逸[15]。本组实验结果显示，结直肠腺癌中PD-L1主要表达于肿瘤间质的免疫细胞，应用PD-L1/PD-1抑制剂治疗结直肠癌的相关机制值得深入探究。

CD8+T细胞的表达多用来评估癌症患者预后，PD-L1与CD8+T细胞在肿瘤组织中高表达提示对PD-L1/PD-1抑制剂敏感性更强，预后较好[16]。本组non-MCA中有23%的PD-L1和CD8同时高表达，MCA中PD-L1表达均较低。研究发现在结直肠癌中PD-L1 mRNA表达与γ干扰素(interferon-γ, IFN-γ)基因表达有关，T细胞分泌的IFN-γ能促进活化的免疫细胞表达PD-L1[17]。但依然有7%的non-MCA组织中PD-L1高表达和CD8低表达，22%的PD-L1低表达和CD8高表达，这表明PD-L1表达和调控还受其它因素影响。

尽管目前研究结果显示，对于结直肠腺癌，PD-1/PD-L1抑制剂主要在MSI-H肿瘤中表现较好的疗效[18]，但亦有研究表明细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(cytotoxic T-lymphocyte associated antigen-4, CTLA-4)和PD-1/PD-L1双重抑制对于治疗MSS结直肠癌有一定疗效[19]，研究显示地西他滨能增强PD-1/PD-L1抑制剂治疗MSS结直肠癌的作用[20]，这表明PD-1/PD-L1抑制剂用于治疗MSS结直肠癌的应用前景值得进一步探索。此外，本组实验结果显示，PD-L1阳性的结直肠腺癌主要表达于直肠和乙状结肠。

综上所述，结直肠腺癌中PD-L1主要表达于肿瘤间质的免疫细胞，进一步研究免疫细胞PD-L1的作用机制及其表达和调控，将对应用免疫疗法治疗结直肠腺癌提供重要理论基础。