蟾酥壳聚糖微球的制备及体外释药性研究

刘 莉 李宗云 何世学 赵 越 张春宝

1.河北省衡水市人民医院制剂科，河北衡水 053000；2.河北省衡水市人民医院临床药学科，河北衡水 053000

中华大蟾酥或黑框蟾蜍的干燥分泌物为蟾酥[1-2]，临床用于调控血压[3]、调节免疫力[4]、抗肿瘤等[5-6]。蟾酥作为中药制剂的常用药物，包括脂溶性成分和水溶性成分。5-羟色胺和蟾蜍色胺是主要的水溶性成分[7]，脂溶性成分为蟾毒内酯类[8-9]。酯蟾毒配基及华蟾酥毒基为蟾毒内酯的主要成分[10]，因蟾酥配基具有毒性，在临床上应用时常有中毒及过敏的报道，限制了其应用。缓控释制剂不仅能更快地达到稳态血药浓度、降低给药次数，而且能够给含毒性的中药制剂在临床使用上提供不同的研究方向[11]。查阅文献发现鲜有把蟾酥制成壳聚糖微球这种新剂型的相关研究，因此本文对蟾酥壳聚糖微球进行研究，并对微球内的水溶性及脂溶性成分进行了相关研究。

微球有增加稳定性、提高生物利用率等特点[12-13]。本研究把脱乙酰壳聚糖作为载体，通过乳化-交联法来制作蟾酥壳聚糖微球，并观察研究其在体外的释药特性。

1 仪器与试药

1.1 仪器

1260 高效液相色谱仪(美国Agilent 公司，可变波长紫外检测器)；SQP 电子天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司，精密度：0.01 mg]；KDC-1042 低速离心机(科大创新股份有限公司)；激光粒度分析仪(欧美克科技有限公司)；RCZ-8AA 智能药物溶出仪(天津大学精密仪器厂)；UV-2700 紫外分光光度计(岛津)。

1.2 药物与试剂

脱乙酰壳聚糖(脱乙酰度＞90%，玉环县海洋生物化学有限公司)；蟾酥(河北康博药业有限公司，20150521，经河北省衡水市人民医院中医科肖红主任鉴定为蟾酥饮片)；华蟾酥毒基对照品(中国食品药品检定研究院，110803～200505，纯度≥99.6%)；酯蟾毒配基对照品(中国食品药品检定研究院，7189306，纯度≥98%)；5-羟色胺对照品(中国食品药品检定研究院，10015～201706，纯度≥98%)；三氯甲烷(莱阳市精细化工厂，20180310)；丙酮(烟台远东精细化工厂，20180901)；正丁醇(天津市恒兴化学试剂精造有限公司，20181006)；乙腈(美国fisher chemicals，08412，色谱纯)；水为高纯水。

2 方法与结果

2.1 蟾酥壳聚糖的制备

2.1.1 处方 水相：1%醋酸、1%脱乙酰壳聚糖、蟾酥；油相：液体石蜡；乳化剂：司盘60；固化剂：戊二醛。

2.1.2 制备方法 取壳聚糖1.00 g 溶于99 mL 水中，搅拌均匀，搅拌的同时加入1 mL 冰醋酸，混匀，备用。0.20 g 蟾酥加20 mL 乙醇使溶解，将上述两种液体混匀。放置过夜，静止消泡，备用[14-16]。取1.00 g 司盘60加200 mL 液体石蜡，搅拌使其混合均匀。将水相加入油相中，搅拌1 h，搅拌同时加入12 mL 戊二醛，3 h，使固化，高倍显微镜下观察没有粘连现象。低速离心机下离心10 min，转速3000 r/min，离心半径13 cm，取下层，经石油醚多次洗涤后，80℃真空干燥箱干燥24 h，收集得到微球。

2.2 鉴别

2.2.1 蟾毒内酯类成分 取相当于0.20 g 的微球，加10 mL 乙醇，加热回流30 min，放冷，过滤，滤液置于10 mL 量瓶，乙醇稀释至刻度，为供试品溶液。精密称取酯蟾毒配基、华蟾酥毒基对照品，稀释成浓度为1 mg/mL 的溶液，为对照品溶液。吸取供试品、对照品液各8 μL，点于同一硅胶G 板，环己烷-三氯甲烷-丙酮(4∶3∶3)展开剂中展开，取出，晾干，喷以10 %硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰。结果供试品色谱中，与对照品色谱相应的位置上，均有2 个斑点且阴性没有干扰，见图1A(封三)。

图1 蟾酥壳聚糖微球的薄层鉴别(见内文第32 页)

2.2.2 蟾毒色胺类成分 取相当于0.20 g 的微球，加50 mL 水，煎煮3 次，每次1 h，滤过，合并滤液置于100 mL 量瓶中，加水稀至刻度，摇匀，为供试品溶液。吸取供试品、对照品液各8 μL，点于同一硅胶G 板，正丁醇-醋酸-水(4∶1∶5)展开剂中展开，取出，晾干，喷以20%对二甲氨基苯甲醛盐酸溶液，加热至斑点显色清晰。结果供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点且阴性没有干扰，见图1B(封三)。

2.3 含量测定方法

2.3.1 色谱条件与适用性试验 Diamonsil(C185 μm，250 mm×4.6 mm)，流动相：乙腈-0.5%磷酸二氢钾(52∶48)，磷酸调pH 为3.0，检测波长：296 nm，流速：1.00 mL/min，柱温：40℃；进样：10 μL[17-19]。见图2。

图2 高效液相色谱图

2.3.2 对照品溶液的制备 精密称取干燥至恒重的华蟾酥毒基对照品1.00 mg、酯蟾毒配基对照品0.90 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，浓度分别为100、90 μg/mL，备用。

2.3.3 供试品溶液的制备 取0.25 g 微球，置于圆底烧瓶中，加25 mL 甲醇，称重。加热回流1 h，放冷，再次称重，差值用甲醇补足，取续滤液，即得。

2.3.4 线性关系考察 标准曲线绘制：分别精密量取华蟾酥毒基或酯蟾毒配基对照品溶液0.10、0.50、1.00、1.50、3.00、5.00 mL，置5 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，取10 μL，高效液相色谱进行测定。横坐标为对照品溶液浓度(μg/mL)，纵坐标为峰面积，绘制标准曲线，回归方程：华蟾酥毒基Y=7367.4X+4026(r=0.9998)，表明在0.02～1.00 μg 内有很好的线性关系；酯蟾毒配基Y=10865X+7175.5(r=0.9997)，表明在0.018～0.900 μg内有很好线性关系。

2.3.5 精密度试验 取“2.3.2”对照品溶液10 μL，均进样6 次，按“2.3.1”的色谱条件进行测定，考察精密度。华蟾酥毒基及酯蟾毒配基的相对标准偏差(RSD)分别为0.18%和0.27%。

2.3.6 稳定性实验 将浓度分别为5 μg/mL 华蟾酥毒基、18 μg/mL 酯蟾毒配基的溶液，按“2.3.1”条件于0、2、4、6、12、18、24 h 进样10 μL，华蟾酥毒基及酯蟾毒配基RSD 分别为0.44%和0.65%，表明在24 h 内稳定。

2.3.7 重复性试验“2.3.6”相同浓度对照品溶液均取6 份，按“2.3.1”进行测定。华蟾酥毒基及酯蟾毒配基RSD 分别为2.65%和2.35%，说明该方法有很好的重现性。

2.3.8 加样回收率试验 取已知含量的蟾酥粉末10.6 mg，精密称定9 份，另分别加入相当于含量为80%、100%、120%华蟾酥毒基和酯蟾毒配基对照品溶液，按“2.3.1”进行测定。求得华蟾酥毒基平均加样回收率为98.21%，酯蟾毒配基平均加样回收率为97.18%。均得到很好的回收率，可以作为含量测定。见表1～2。

表1 华蟾酥毒基加样回收率结果

表2 酯蟾毒配基加样回收率结果

2.4 微球形态及粒径考察

光学显微镜观察其形态，用激光粒度分析仪测量其粒径，平均粒径为9.20 μm。

2.5 蟾毒内酯类含量测定

称取3 批0.10 g 微球，置于圆底烧瓶中，加50 mL甲醇，称重。回流加热1 h，放冷，再次称重，差值用甲醇补足，滤过，取1 mL 续滤液置于20 mL 量瓶中，定容，为供试品溶液，制作3 份按上述高效液相色谱条件进行检测，测得总载药量平均值为6.06 mg/g。见表3。

表3 蟾毒内酯类成分的载药量(mg/g，n=3)

2.6 包封率测定

精密称取蟾酥壳聚糖微球25 mg，加入10 mL 甲醇，超声提取，放置过夜后将微球研磨，3000 r/min 离心5 min，取上清液置于10 mL 容量瓶中定容，过微孔滤膜，10 μL 进样测定含量，计算包封率[20]，微球的平均包封率为73.30%。见表4。

表4 包封率测定结果(n=3)

2.7 吲哚生物碱类含量测定

取微球0.10 g，置入圆底烧瓶中，加50 倍水，回流加热1 h，提取3 次，冷却，过滤，取续滤液，倒入100 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度作为供试品溶液[21-22]。制作3 份在波长556 nm 处测定吸光度，平均含量为6.59 mg/g。见表5。

表5 吲哚生物碱类含量(n=3)

2.8 体外溶出度

依据2020 版药典[23]，采用浆法测定释放度，溶出介质为人工胃液和人工肠液[24]。取蟾酥微球和蟾酥原料药，入透析袋，置于不同的溶出杯中。温度：(37.0±0.1)℃，转速：(100±1)r/min，介质量：1000 mL，分别在20、60、120、180、240、300、360、420、480、540、600 min 时取1 mL，过膜，差值采用人工胃液或人工肠液进行补足，直到达到平衡，见图3。释放度实验说明：与蟾酥原料药比较，蟾酥壳聚糖微球具有很好的缓释效果。

图3 蟾酥在人工肠液及人工胃液中的溶出曲线

3 讨论

3.1 壳聚糖微球的制备

造成最后制得的微球载药量小，可能是由于应用的1%的壳聚糖含量少，大部分是水分。也可能是由于在放置过夜脱泡时蟾酥随乙醇有部分挥发或在倒入离心杯时有损失又或者在用石油醚洗涤下层时有损失等；在制做微球的过程中，本研究用乙醇溶解，是因为乙醇较甲醇对人体内的危害性小，毒性小，安全性高。

为提高蟾酥的生物利用度，本研究将蟾酥制成具有缓释效果的壳聚糖微球，为减小壳聚糖溶液的黏稠度及更易于乳化，在水相中加入了乙醇，加戊二醛目的是防止微球粘连，使其更易固化。

3.2 蟾酥的溶出

对药物释放速率产生影响的因素有：微球粒径大小不同、囊膜的薄厚不同或骨架、制备工艺的不同、药物自身的剂型等[25-27]。通过上述实验可以看出壳聚糖微球在人工胃液及人工肠液中有很好的缓释作用，可减少药物含量在血液中波动及给药次数，为临床应用提供依据。

对蟾酥的剂型研究，通过查阅相关文献为降低蟾酥的毒性，人们把蟾酥制成各种剂型，如：脂质体、自微乳以及β 环糊精等，但是没有发现把蟾酥制成以壳聚糖为载体的微球，因此把蟾酥制成微球，研究蟾酥壳聚糖微球在体外的释药特性，为进一步进行体内的动物试验提供依据及为最后应用于临床奠定基础。