miR-573通过调控LAIR2对滋养层细胞的增殖、迁移和侵袭的影响

马晓莉 张艳 王雪飞

胎盘正常发育在妊娠与胎儿发育过程中发挥重要作用，而胎盘中的主要细胞是滋养层细胞，滋养层细胞增殖、迁移可造成胎盘缺血缺氧等从而引发子痫前期等妊娠疾病[1,2]。研究表明微小RNA(microRNA，miRNA)可影响滋养层细胞迁移及侵袭能力[3]。但关于其具体作用机制尚未阐明。既往研究常采用HTR8/Svneo细胞等作为探究胎盘滋养层细胞迁移及侵袭的重要细胞模型[4]。研究表明微小RNA-573(microRNA-573，miR-573)在肺癌、宫颈癌等肿瘤中表达量降低，上调其表达可抑制肿瘤细胞增殖及侵袭[5,6]。但miR-573对滋养层细胞增殖、迁移等生物学行为的影响尚未可知。通过生物学分析显示LAIR2可能是miR-573的靶基因，研究表明LAIR2在肾细胞癌细胞表达量升高，并可能参与肾细胞癌发生及发展过程[7]。但miR-573是否可通过调控LAIR2从而影响滋养层细胞增殖、迁移及侵袭尚未可知。因此，本研究以HTR8/Svneo、JEG-3、BeWo、JAR细胞为研究模型，观察miR-573、LAIR2的表达量及其对细胞增殖、迁移及侵袭的影响，探讨其可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 人滋养层细胞系HTR8/Svneo、JEG-3、BeWo、JAR购自美国ATCC公司；RPMI 1640培养基、MEMα培养基、F12K培养基、杜氏改良培养基(DMEM)购自美国Gibco公司；胎牛血清购自美国HyClone公司；Lipofectamine2000与Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；反转录试剂盒与实时荧光定量PCR试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；miR-573寡核苷酸模拟物(miR-573 mimics)及阴性对照mimic NC序列(miR-NC)、LAIR2小干扰RNA(si-LAIR2)、乱序无意义阴性序列(si-NC)、miR-573特异性寡核苷酸抑制剂(anti-miR-573)及其阴性对照(anti-miR-NC)购自上海吉玛制药技术有限公司；pcDNA3.1购自武汉淼灵生物科技有限公司；甲基噻唑基四唑(methylthiazolyl tetrazolium，MTT)购自北京索莱宝科技有限公司；Transwell小室购自美国Corning公司；Matrigel基质胶购自美国BD公司；兔抗人LAIR2抗体购自美国Abcam公司；兔抗人细胞周期蛋白1(CyclinD1)、基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2，MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)抗体购自美国Santa Cruz公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗购自武汉艾美捷科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 实验分组:HTR8/Svneo细胞培养于含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素与100 μg/ml链霉素的RPMI 1640培养基，JEG-3、BeWo、JAR细胞来源于人绒毛膜癌细胞系，JEG-3细胞培养于MEMα培养基，BeWo细胞培养于F12K培养基，JAR细胞培养于DMEM培养基。细胞培养条件为37℃、体积分数5%CO2。取对数期JEG-3细胞，0.25%胰蛋白酶消化，加入培养基调整细胞密度为1×105个/ml，将细胞接种于96孔板(100 μl/孔)，分别将miR-NC、miR-573 mimics、si-NC、si-LAIR2、miR-573 mimics与pcDNA-NC、miR-573 mimics与pcDNA-LAIR2转染至JEG-3细胞，分别记作miR-NC组、miR-573组、si-NC组、si-LAIR2组、miR-573+pcDNA-NC组、miR-573+pcDNA-LAIR2组。转染过程参照Lipofectamine2000试剂说明书进行操作，转染48 h后收集对数期细胞。

1.2.2 实时荧光定量聚合酶链反应(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)检测细胞中miR-573、LAIR2 mRNA的表达水平:采用Trizol法提取细胞中的总RNA，应用Nanodrop2000c超微量分光光度计检测RNA浓度与纯度。参照反转录试剂盒说明书将总RNA反转录合成cDNA，以cDNA为模板进行qRT-PCR反应，反应体系：SYBR Green Master Mix 10 μl/孔，正反向引物0.8 μl/孔，cDNA 1 μl/孔，ddH2O补足体系至20 μl；反应条件：95℃ 2 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共循环40次。miR-573以U6为内参，LAIR2以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法计算miR-573、LAIR2 mRNA的相对表达量。

1.2.3 MTT检测细胞增殖:收集各组转染后的JEG-3细胞，按照每孔5×104个细胞的密度接种于96孔板，每组设置3个复孔，转染48 h时，向每孔加入20 μl MTT溶液，置于37℃、体积分数5%CO2培养箱继续培养4 h，弃上清，每孔加入150 μl DMSO，室温避光孵育5 min，应用酶标仪检测各孔吸光度值(A值)，计算细胞存活率[(A 转染组-A 空白对照组)/(A 阴性对照组-A空白对照组)×100%]，实验重复3次。

1.2.4 Transwell实验检测细胞迁移与侵袭:①细胞迁移实验：收集各组转染后的JEG-3细胞，调整细胞密度为3×104个/ml，按照每孔200 μl的密度接种于Transwell小室的上室，取600 μl含有10%胎牛血清的培养液加入Transwell小室的下室，37 ℃恒温培养箱中继续培养24 h，PBS洗涤，多聚甲醛固定20 min，0.1%结晶紫染液染色10 min，显微镜下观察迁移细胞数。②细胞侵袭实验：预冷培养基按照1∶8比例稀释Matrigel基质胶，按照每孔40 μl的密度将稀释后的Matrigel基质胶加入Transwell小室的上室，37℃恒温培养箱中继续培养5 h，后续实验步骤同细胞迁移实验，显微镜下观察侵袭细胞数。

1.2.5 双荧光素酶报告基因检测miR-573的靶基因:TargetScan预测显示LAIR2的3’UTR区含有miR-573的结合位点，利用基因突变技术将结合位点进行突变，分别将含有结合位点与突变位点的序列插入荧光素酶报告基因载体构建野生型载体WT-LAIR2、突变型载体MUT-LAIR2，分别将miR-NC、miR-573 mimics与WT-LAIR2、MUT-LAIR2共转染至JEG-3细胞，检测各组细胞荧光素酶活性。分别将miR-NC、miR-573 mimics、anti-miR-NC、anti-miR-573转染至JEG-3细胞，蛋白免疫印迹法(western blot)检测各组细胞中LAIR2蛋白水平。

1.2.6 Western blot检测LAIR2、CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表达:收集HTR8/Svneo、JEG-3、BeWo、JAR细胞及各组对数期JEG-3细胞，加入适量RIPA裂解液，冰上裂解30 min，提取细胞总蛋白。根据BCA定量检测试剂盒检测蛋白浓度，蛋白样品加入5×SDS上样缓冲液，沸水煮10 min，蛋白变性。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，加入一抗稀释液(1∶1 000)，4℃孵育24 h，TBST洗涤，加入二抗稀释液(1∶5 000)，室温孵育1 h，滴加ECL显影，应用ImageJ软件分析各条带灰度值。

2 结果

2.1 miR-573和LAIR2在人滋养层细胞系中的表达情况 与HTR8/Svneo细胞比较，JEG-3、BeWo、JAR细胞中miR-573的表达水平显著降低(P<0.05)，LAIR2 mRNA及蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。见图1，表1。

图1 Western Blot检测LAIR2蛋白表达

表1 miR-573和LAIR2在人滋养层细胞系中的表达情况

2.2 过表达miR-573对JEG-3细胞增殖、迁移和侵袭的影响 与miR-NC组比较，miR-573组细胞存活率显著降低(P<0.05)，迁移细胞数与侵袭细胞数显著减少(P<0.05)，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平显著降低(P<0.05)。见表2，图2。

表2 过表达miR-573对JEG-3细胞增殖、迁移和侵袭的影响

图2 Western Blot检测CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白的表达

2.3 敲减LAIR2对JEG-3细胞增殖、迁移和侵袭的影响 与si-NC组比较，si-LAIR2组细胞存活率显著降低(P<0.05)，迁移细胞数与侵袭细胞数显著减少(P<0.05)，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平显著降低(P<0.05)。见表3，图3。

图3 Western Blot检测LAIR2、CyclinD1、MMP-2和MMP-9的蛋白表达

表3 敲减LAIR2对JEG-3细胞增殖、迁移和侵袭的影响

2.4 miR-573靶向LAIR2 TargetScan预测显示miR-573和LAIR2存在结合位点。双荧光素酶报告实验结果显示，miR-con或miR-573与野生型载体WT-LAIR2共转染JEG-3细胞后，与miR-NC组比较，miR-573组荧光素酶活性显著降低(P<0.05)；miR-con或miR-573与突变型载体MUT-LAIR2共转染JEG-3细胞后，miR-573组荧光素酶活性与miR-NC组比较差异无统计学意义(P>0.05)。与miR-NC组比较，miR-573组细胞中LAIR2蛋白水平显著降低(P<0.05)；与anti-miR-NC组比较，anti-miR-573组细胞中LAIR2蛋白水平显著升高(P<0.05)。见表4、5，图4。

表4 miR-con或miR-573与报告质粒共转染JEG-3细胞后双荧光素酶活性检测

表5 Western Blot检测LAIR2的表达

图4 miR-573靶向调控LAIR2表达；A TargetScan对miR-573和LAIR2结合进行预测示意图;B Western Blot检测LAIR2表达量

2.5 高表达LAIR2可以逆转miR-573对JEG-3细胞增殖、迁移和侵袭的影响 与miR-573+pcDNA-NC组比较，miR-573+pcDNA-LAIR2组细胞存活率显著升高(P<0.05)，迁移细胞数与侵袭细胞数显著增多(P<0.05)，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平显著升高(P<0.05)。见图5，表6。

图5 Western Blot检测LAIR2、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表达

表6 高表达LAIR2可以部分逆转miR-573对JEG-3细胞增殖、迁移和侵袭

3 讨论

妊娠期间胎儿正常发育与胎盘功能密切相关，滋养层细胞分化及迁移可促进胎盘发育，但滋养层细胞过度增殖、迁移及侵袭可促使妇产科疾病的发生，因而探究滋养层细胞迁移及侵袭的分子机制对维持胎盘正常发育具有重要意义，研究表明miRNA在滋养层细胞迁移及侵袭过程中发挥重要作用[8-10]。但仍有部分miRNA在滋养层细胞增殖、迁移及侵袭过程中的调控机制尚未阐明。

miR-573可抑制前列腺癌细胞转移[11]。miR-573表达量降低可促进黑色素瘤、胃癌等肿瘤增殖及迁移[12,13]。本研究结果显示人滋养层细胞系中miR-573的表达量显著降低，提示miR-573表达量降低可能影响胎盘发育。本研究通过上调miR-573表达，结果显示JEG-3细胞增殖、迁移及侵袭能力显著降低，提示miR-573过表达可抑制滋养层细胞增殖、迁移及侵袭。为探讨miR-573调节滋养层细胞增殖、迁移及侵袭的分子机制，本研究检测miR-573过表达后细胞增殖、迁移及侵袭相关蛋白的表达，结果显示miR-573过表达处理后细胞中CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平显著降低，已有报道指出CyclinD1可正向调控细胞周期，促进细胞增殖，而滋养层细胞可通过分泌MMP-2、MMP-9等基质金属蛋白酶从而加强细胞浸润性[14,15]。提示miR-573过表达可能通过降低CyclinD1、MMP-2、MMP-9表达从而抑制滋养层细胞增殖、迁移及侵袭。

皮肤T细胞淋巴瘤中LAIR2的表达量升高并可促进细胞迁移及侵袭[16]。研究表明LAIR2表达量升高与人绒毛外滋养层细胞的高度侵袭性密切相关[17,18]。与上述研究结果显示LAIR2在滋养层细胞中表达量升高，通过敲减LAIR2可减弱滋养层细胞增殖、迁移及侵袭能力，并可抑制CyclinD1、MMP-2、MMP-9表达。提示抑制LAIR2表达可降低滋养层细胞增殖、迁移及侵袭能力。本研究通过双荧光素酶报告实验与Western blot实验证实miR-573能够靶向结合LAIR2，并可负向调控LAIR2的表达。为探究miR-573是否可通过调控LAIR2表达从而影响滋养层细胞增殖、迁移及侵袭能力，本研究通过上调LAIR2表达联合miR-573过表达处理滋养层细胞，结果显示细胞增殖、迁移及侵袭能力显著升高，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平显著升高，提示miR-573过表达可能通过靶向调控LAIR2表达从而抑制滋养层细胞增殖、迁移及侵袭进而维持胎盘正常发育。

综上所述，滋养层细胞中miR-573表达量降低，miR-573过表达可靶向抑制LAIR2表达从而抑制细胞增殖、迁移及侵袭，其作用机制可能与降低CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达有关，可为进一步揭示滋养层细胞增殖、迁移及侵袭的分子机制奠定理论基础。