消瘤止痛凝胶的质量标准研究

李 江，李争艳，王 飘，李 娇，付 鹏，彭 霜，陈凌云*

(1.昆明市中医医院，昆明 650500；2.云南中医药大学云南省高校外用给药系统与制剂技术研究重点实验室，昆明 650500；3.玉溪市红塔区妇幼保健院，玉溪 653100)

消瘤止痛凝胶由土茯苓、姜黄、山慈菇、海风藤、蜈蚣等13味药材经提取制成，具有化痰散结、活血止痛、解毒消瘤的功效，主治肿瘤所致的疼痛。方中土茯苓和姜黄为君药，土茯苓中的落新妇苷具有抗炎镇痛、抗肿瘤的效果[1-2]，姜黄中的姜黄素具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤的特点[3-5]，山慈姑、海风藤和蜈蚣药材具有抗肿瘤、镇痛的效果[6-8]。

本文以上述两味君药中的标志性成分落新妇苷和姜黄素为指标进行了含量测定研究，对方中所有被《中国药典》2015年版收录且定有TLC鉴别项的药味进行了研究，建立了5味药材的鉴别方法。同时，建立了体外释放度的检测方法，为本品质量标准的提升和药品生产批文的申报奠定了基础。

1 仪器与试药

1.1仪器 Agilent 1100型高效液相色谱系统(美国Agilent公司)；Diamonsil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，迪马科技公司)；T-1000型电子天平(美国双杰兄弟有限公司)；AB265-SMETTLER TOLEDO分析天平(瑞士梅特勒-托利多集团)；SK2200HP型超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；薄层层析硅胶G板(青岛海洋化工分厂、青岛鼎康硅胶有限公司)。

1.2试药 消瘤止痛凝胶，由云南中医药大学第三附属医院提供(批号分别为20193211、20193212、20193220)。土茯苓对照药材(批号121439-201803)，冰片对照药材(批号111688-201602)，丁香对照药材(批号121039-201405)，肉桂对照药材(批号121363-201703)，细辛对照药材(批号121204-201606)，落新妇苷对照品(批号111798-201504，质量分数为93.9%)，姜黄素对照品(批号110823-201706，质量分数为98.7%)，均购自中国食品药品检定研究院。乙腈、甲醇为色谱纯(德国默克公司)，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1TLC鉴别

2.1.1土茯苓 取消瘤止痛凝胶5 g，加入甲醇50 mL，超声处理20 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液[9]。另取土茯苓对照药材0.2 g，同法制成对照药材溶液。另取不含土茯苓的凝胶0.2 g，同法制成阴性对照溶液。按照《中国药典》2015年版TLC法(通则0502)实验，吸取上述3种溶液各8 μL，分别点于同一硅胶G板上，以正己烷-乙酸乙酯(8∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以100 mL·L-1硫酸乙醇，在105 ℃加热至斑点清晰。结果显示，供试品溶液色谱与对照药材溶液色谱相应位置上均显相同颜色的斑点，且阴性对照无干扰。见图1A。

2.1.2冰片 取消瘤止痛凝胶5 g，加入三氯甲烷25 mL，超声处理20 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。取冰片对照药材5 mg，同法制成对照药材溶液。另取不含冰片的凝胶5 g，同法制成阴性对照溶液。按照《中国药典》2015年版TLC法(通则0502)实验，分别吸取上述3种溶液4、10、10 μL，分别点于同一硅胶G板上，以乙酸乙酯-环己烷(5∶20)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以50 mL·L-1香草醛硫酸溶液，在105 ℃加热至斑点清晰[10]。结果显示，供试品溶液色谱与对照药材溶液色谱相应位置上均显相同颜色的斑点，且阴性对照无干扰。见图1B。

2.1.3丁香 取消瘤止痛凝胶5 g，加入乙醚25 mL，超声处理20 min，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醚1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取丁香对照药材0.2 g，同法制成对照药材溶液。另取不含丁香的凝胶5 g，同法制成阴性对照溶液。分别吸取上述3种溶液10、10、4 μL，分别点于同一硅胶G板上，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(9∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以50 mL·L-1香草醛硫酸溶液，在105 ℃加热至斑点清晰[11]。结果显示，供试品溶液与对照药材溶液色谱相应位置上均显相同颜色的斑点，且阴性对照无干扰。见图1C。

2.1.4肉桂 取消瘤止痛凝胶5 g，加入石油醚(60～90 ℃)50 mL，超声处理20 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液[12]。取肉桂对照药材0.2 g，同法制成对照药材溶液。另取不含肉桂的凝胶5 g，同法制成阴性对照溶液。分别吸取上述3种溶液4、10、10 μL，点于同一硅胶G板上，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(15∶3)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以二硝基苯肼乙醇试液，在105 ℃加热至斑点清晰。结果显示，供试品溶液与对照药材溶液色谱相应位置上均显相同颜色的斑点，且阴性对照无干扰。见图1D。

图1 TLC图

2.1.5细辛 取2.1.1项下制备的供试品溶液[13]。取细辛对照药材0.3 g，同法制成对照药材溶液。取不含细辛的凝胶5 g，同法制成阴性对照溶液。分别吸取上述3种溶液10、10、5 μL，分别点于同一硅胶G板上，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(3∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以50 mL·L-1香草醛硫酸溶液为显色剂，在105 ℃加热至斑点清晰。结果显示，供试品溶液与对照药材溶液色谱相应位置上均显相同颜色的斑点，且阴性对照无干扰。见图1E。

2.2体外释放度检查方法考察

2.2.1落新妇苷的含量测定 精密称取落新妇苷对照品适量，加甲醇制成质量浓度为200 μg·mL-1的落新妇苷对照品溶液。取对应释放时间的释放介质50 mL，水浴蒸干，加甲醇定容至5 mL，作为供试品溶液。取不含土茯苓的凝胶，按照上述方法制备阴性对照溶液。

色谱条件及方法学考察：采用Diamonsil C18色谱柱；流动相：乙腈-1 mL·L-1磷酸(31∶69)；流速：1 mL·min-1；检测波长：291 nm；柱温：30 ℃；进样量：30 μL；理论塔板数以落新妇苷峰计不低于4 000。落新妇苷在6.02～77.48 μg·min-1范围内线性关系良好，回归方程为y=13.30x-6.96(r=0.999 5)，定量限为6.02 μg·min-1，准确度实验中，平均回收率为99.43%，RSD=2.96%(n=6)，精密度、稳定性、重复性RSD值均<2.0%。

2.2.2影响因素实验 以落新妇苷的释放度为评价指标，按照《中国药典》2015年版四部通则0931第三法(小杯法)，称取消瘤止痛凝胶2 g，置于透析袋中(截留相对分子质量范围12 000～14 000)，转速为100 r·min-1，待恒温至37 ℃开始实验，考察水、生理盐水、磷酸盐缓冲液[14-15](pH=7.4和5.8模拟创面和皮肤的pH)、10 g·L-1吐温80溶液[16]对释放度的影响，并在此基础上对转速(75、100、125 r·min-1)和半透膜不同截留相对分子质量范围(3 500、7 000和8 000～14 000)及样本使用量(1、2、3 g)进行考察。结果显示，在释放介质考察中，10 g·L-1吐温80溶液释放度最快且释放度最高。在转速考察中，125 r·min-17 h开始累积释放度与100 r·min-1相当，但前期释放速度略快，参考标准起草及研究文献中使用100 r·min-1进行测定的较多，而125 r·min-1使用很少且二者释放曲线较为相近，故确定100 r·min-1为最佳转速。在透析袋截留相对分子质量范围考察中，发现其对释放度影响较小，截留相对分子质量范围为8 000～14 000时，累积释放度相对较大，故选取该型号的透析袋进行实验。在样品取样量考察中，取1 g时5 h前的释放度测定无法达到定量限的要求，不利于后期曲线的模型拟合，取3 g时的释放度低于2 g，故确定2 g为取样量。结果见图2。

图2 释放度考察单因素实验结果

2.2.3释放机制分析 采用Origin Pro 8.0对2 g取样量对应的累积释放曲线进行Zero-order方程、First-order方程、Higuchi方程、Ritger-Peppa方程和SWeibull 1方程拟合。结果显示，SWeibull 1方程的拟合度最高，说明其释放机制以扩散为主[17-19]。结果见表1。

表1 累积释放曲线方程拟合结果

2.2.4释放度均一性考察 取3批样品，每批2份，按照2.2.1项下色谱条件进样测定。结果显示，7 h时平均累积释放度为80.85%(n=6，RSD=3.44%)，且各取样点下释放度的RSD值均小于6.50%(n=6)，表明释放度均一性良好。结果见表2。

4)由于的长度有限，称作FIR滤波器。为矩形脉冲序列，每个元素均为1，整个卷积运算过程相当于对输入信号求相邻6个元素的平均值，因此可以理解为平滑滤波过程。

表2 释放度均一性考察结果 (n=2)

2.3HPLC-DAD法同时测定落新妇苷和姜黄素的含量

2.3.1溶液的制备 取落新妇苷和姜黄素对照品适量，加甲醇配制成质量浓度分别为200、10 μg·mL-1的落新妇苷对照品溶液和姜黄素对照品溶液。取消瘤止痛凝胶2 g，加甲醇定容至10 mL，称定质量，超声5 min，补足减失的质量，取续滤液作为供试品溶液。分别取不含土茯苓、姜黄的2种阴性凝胶，按照上述方法制备土茯苓阴性对照溶液和姜黄阴性对照溶液。

2.3.2线性关系及范围考察所需溶液的配制 精密称取姜黄素对照品2.48 mg，加甲醇定容至10 mL，作为姜黄素对照品储备液。精密称取落新妇苷对照品3.82 mg，并取姜黄素对照品储备液1 mL，加甲醇定容至10 mL，取6 mL，再加甲醇定容至10 mL，按此比例反复稀释，配制得落新妇苷的质量浓度依次为358.70、215.22、129.13、77.48、46.49、27.89 μg·mL-1及姜黄素的质量浓度依次为24.48、14.69、8.81、5.29、3.17、1.90 μg·mL-1的系列混合对照品溶液。

2.3.3色谱条件及方法学考察 色谱柱为Diamonsil C18柱；流动相：乙腈(A)-1 mL·L-1磷酸(B)(0～26 min，10%A；26～40 min，10%A～30%A；40～50 min，30%A～50%A)；流速：1 mL·min-1；落新妇苷和姜黄素检测波长分别为291、430 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。在系统适用性实验中，供试品色谱中落新妇苷、姜黄素色谱峰与相邻色谱峰分离度均大于1.50，理论塔板数以落新妇苷峰计算不低于4 000，阴性对照无干扰。二者分别在27.89～358.70、1.90～24.48 μg·mL-1范围内线性关系良好，回归方程分别为y1=5.11x1-24.65(r1=0.999 6)、y2=166.26x2+4.86(r2=0.999 9)。在准确度实验中平均回收率分别为100.35%、99.97%，RSD值分别为2.74%、2.63%(n=9)，精密度、稳定性、重复性实验中相应RSD值均<2.0%。结果见图3。

图3 HPLC图

2.3.4落新妇苷和姜黄素的含量测定 取3批样品，各2份，按照2.3.1项下方法制备供试品溶液，按照2.3.3项下色谱条件进样检测。结果显示，落新妇苷和姜黄素的平均含量分别为660.16、10.20 μg·g-1，RSD值分别为2.41%、2.16%(n=6)。

3 讨论

TLC法在药物分析中具有快速、简便、成本低等优点，本文依此建立了样品中5味药材的鉴别方法。由于TLC鉴别常受温度、湿度、薄层板厂家、样品批次等因素的影响，故本研究依据《云南省中药材(民族药材)质量标准研究技术指导原则(试行)》对5味药材的TLC鉴别进行了分析方法验证及重复性考察，结果均符合指导原则中的要求。

双波长-HPLC法可在1次进样后同时采用2个检测波长对样品进行分析，其可对吸收波长差异较大的多种物质同时分析，较单波长HPLC法更便捷。实验对样品含量测定的供试品制备方法进行了考察，分别采用甲醇、乙醇提取及有机溶剂萃取后复溶的方法制备，结果优选出的甲醇超声溶解所得含量最佳，符合分析方法验证的相关要求。

综上所述，本研究建立了消瘤止痛凝胶中5种药材的TLC鉴别方法，并对该方法进行了方法学考察，同时对土茯苓和姜黄中落新妇苷和姜黄素的含量测定进行了研究，为本品质量标准的提升提供了参考，将有利于本品的质量控制，保障其临床疗效，促进其临床推广。