麦冬皂苷B通过调控miR-432-5p 抑制A549细胞增殖、迁移和侵袭

李丽秋，高 倩，顾 玲，李志辉，王 进，许 微，张雄飞，张 旭，陈美娟

(南京中医药大学医学院·整合医学学院，江苏 南京 210023)

非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer, NSCLC)约占所有肺癌病例的80%-85%，而腺癌是NSCLC最常见的类型。尽管近年肿瘤治疗手段已经取得较大进展，但由于肿瘤耐药、复发和转移等问题，肺癌患者死亡率仍高居不下[1]。

“周氏克金岩方”(来自国医大师周仲瑛教授)为临床抗肺癌的有效验方，麦冬皂苷B(Ophiopogonin-B，OP-B)是从此复方中通过高通量筛选分离出来的有效单体。课题组前期研究证实OP-B可抑制NSCLC细胞增殖[2]、转移和侵袭，诱导自噬和凋亡，充分显示了OP-B多用途的优势。

microRNA广泛参与肿瘤细胞的增殖、转移、侵袭及凋亡，对肿瘤发展具有重要意义[3]。研究发现，OP-B可通过Linc00668/miR-432-5p/EMT轴抑制肺癌细胞的上皮-间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)[4]，然而，miR-432-5p在NSCLC中的作用尚未明确，OP-B调控miR-432-5p发挥抗肿瘤作用的分子机制有待进一步阐明。

1 材料与方法

1.1 材料A549、H1299、SK-MES-1和H460均购自中国科学院细胞库/干细胞库。麦冬皂苷-B(南京世洲生物科技, SZ20180901MDZGB)；miR-432-5p mimics和miR-NC均委托南京锐真生物技术有限公司构建；EdU-594增殖检测试剂盒(碧云天生物)；Transwell小室(Corning)；E-cadherin、MMP-2、Snail、β-actin一抗及羊抗兔、羊抗鼠二抗，均购自CST；miRNA第一链DNA合成(茎环法)、miRNA荧光定量PCR试剂盒购自生工生物；Matrigel胶(BD)；Lipofectamine 2 000(Invitrogen)。

1.2 细胞转染取1×106个A549细胞接种在6孔板中培养24 h，直至细胞70%-90%融合。根据Lipofectamine2000说明书转染，实验分为阴性对照(NC)组和miR-432-5p过表达组。

1.3 RNA提取与qRT-PCR检测空白组不做处理，两个实验组分别以2.5、5 μmol·L-1OP-B处理24 h后，按照TRIzol说明书分离总RNA，并进行逆转录和荧光定量。引物序列见Tab 1。

Tab 1 qRT-primer sequence(5′→3′)

1.4 EdU细胞荧光染色按照EdU-594说明书操作，每组设3个复孔，染色完成后荧光显微镜下观察。细胞相对增殖率/%=(EdU染色阳性细胞数/总细胞数)×100%。

1.5 平板克隆形成实验每孔接种500个A549细胞于6孔板中，设3个复孔，7 d后取出，固定、染色，拍照计数。

1.6 划痕实验各组A549细胞长满后，用无菌枪头划痕，24 h、48 h后取出拍照记录，计算相对划痕宽度/%=(W 24 h或W 48 h)/W 0 h×100%，实验重复3次。

1.7 Transwell实验检测细胞迁移与侵袭迁移实验：上室加各组100 μL A549细胞无血清悬液(5×104个/孔)，下室加500 μL全培，24、48 h后固定染色；侵袭实验铺胶后步骤同上。

1.8 Western blot检测细胞内相关蛋白变化提取NC组、miR-432-5p mimics过表达组及过表达联合OP-B 5 μmol·L-1给药组蛋白后，进行电泳、转膜，孵一抗、二抗，曝光后Image Lab分析条带。

1.9 统计学分析统计分析采用Graphpad Prism 9.0软件。组间差异采用t检验和单因素方差分析。

2 结果

2.1 OP-B对不同NSCLC细胞株中miR-432-5p表达的影响qRT-PCR结果示，在5 μmol·L-1OP-B条件下，肺腺癌细胞A549中miR-432-5p表达明显上调(P<0.01)，选取A549细胞进行后续实验。

2.2 过表达miR-432-5p抑制A549细胞增殖qRT-PCR证实mimics转染明显上调miR-432-5p表达(P<0.01)。EdU荧光染色和平板克隆均证实miR-432-5p抑制A549细胞增殖(P<0.01或P<0.05),结果见Tab 2。

2.3 过表达miR-432-5p抑制A549细胞迁移和侵袭划痕实验结果表明，转染miR-432-5p mimics 24 h和48 h后，与对照组相比细胞迁移水平得到显著抑制(P<0.01)；如Tab 2示，Transwell迁移、侵袭实验证实了上述结果(P<0.01)。

Tab 2 The effects of miR-432-5p on A549 cells proliferation, migration and invasion

2.4 OP-B调控miR-432-5p对侵袭转移相关蛋白表达的影响miR-432-5p过表达组和过表达联合OP-B(5 μmol·L-1)给药组中，E-cadherin蛋白水平明显上调，MMP-2则下调；Snail在miR-432-5p过表达后下调，联合OP-B给药后则更显著下调。

3 讨论

麦冬皂苷B提取自传统中药麦冬，具有明显抗肿瘤作用。前期研究发现 Linc00668直接靶向miR-432-5p，而OP-B则介导Linc00668竞争性抑制miR-432-5p，从而发挥抗NSCLC细胞转移的作用[4]。研究表明，miR-432-5p不仅仅发挥抗肿瘤作用，还可促进肿瘤进展，然而肺癌中关于miR-432-5p的功能研究相对缺乏，OP-B调控该microRNA发挥抗肿瘤作用的分子机制在很大程度上尚不清楚。本研究以肺腺癌细胞A549为实验对象，通过EdU荧光染色和克隆形成实验证实miR-432-5p的增殖抑制作用，划痕和Transwell实验则证实了其迁移、侵袭抑制作用。EMT在肿瘤的侵袭和转移过程中发挥重要作用[5]，通过Western blot检测E-cadherin、MMP-2、Snail等蛋白，发现了miR-432-5p对EMT通路的抑制，且OP-B协同miR-432-5p的抑制效应尤为显著。

本研究证实了miR-432-5p抗NSCLC的作用，揭示了OP-B通过调控miR-432-5p发挥抗A549细胞增殖、迁移和侵袭的部分机制，对于其如何通过miR-432-5p作用于下游的EMT相关信号通路，及其靶点作用机制仍有待深入研究。