马桑相关产业开发中马桑蚕沙制备叶绿素酮钠盐粗品工艺研究*

吴新文，陈 恺，马 凯，张世芹，谢元贵，谢 锋▲

(1贵州省检测技术研究应用中心，贵州 贵阳 550002；2贵州省分析测试研究院，贵州 贵阳 550002；3贵州省山地资源研究有限公司，贵州 贵阳 550002)

0 引言

马桑用途很多，枝叶可做燃料、肥料、饲料、养蚕等，目前马桑相关产业中就有利用马桑养蚕的产业，随着科学技术的进步和综合利用的开发，马桑蚕的利用逐步走向茧、蛹、成虫、幼虫、卵及蚕沙的全面开发路线，从而马桑蚕沙的开发利用也成了马桑相关产业中的一个重要产业[1-2]。蚕沙进一步富集了叶绿素[3]，风干的蚕沙叶绿素含量高达0.8%～1.0%，是优良的天然绿色素资源。由于纯天然的叶绿素性质很不稳定，而且不容于水，难以广泛应用在实际应用中。而叶绿素的衍生物叶绿素铜钠盐为天然绿色色素，易溶于水，又比较稳定，而且染色能力强[4]，可作为食品和日化加工中的染色剂、脱色剂，广泛应用于口香糖、硬糖、果汁、汽水、洗手液、除臭剂中[5]。目前叶绿素铜钠盐的制备多以各类物质为原料提取叶绿素后，再以铜离子取代叶绿素中的镁离子制成叶绿素铜钠盐。这篇论文选择马桑蚕沙为原料，对制备叶绿素铜钠盐粗品的工艺进行了研究，所得产品可作为进一步提纯叶绿素铜钠盐的原材料。为充分利用资源，更好地发展马桑相关产业提供技术支撑。

1 实验部分

1.1 原料、仪器设备和试剂

主要原料：马桑蚕沙(收集于贵州某马桑蚕养殖基地)。

主要仪器设备：721型分光光度计、减压过滤装置、旋转蒸发仪、回流装置、电子天平、恒温磁力搅拌水浴锅、酸度计及常用玻璃仪器。

主要试剂：95%乙醇溶液、NaOH溶液、6 mol/L盐酸溶液、丙酮、石油醚、10%CuSO4溶液、蒸馏水、30%乙醇溶液、5%NaOH-乙醇溶液、叶绿素铜钠盐对照品(纯度98.0%)。

1.2 原理与方法

1.2.1 原理

叶绿素是一种天然色素，叶绿素有a和b两种，在叶绿素的结构中，含有一个由四个吡咯环和四个次甲基交替相联形成的卟吩环，卟吩环闭合的共轭体系提供了包围镁离子的刚性平面，叶绿素与蛋白质结合存在于植物的绿叶和绿色的茎中，是植物进行光合作用所必需的催化剂，叶绿素难溶于水，而易溶于极性有机溶剂。

利用马桑饲养的马桑蚕排出的蚕粪(马桑蚕沙)中富集了丰富的叶绿素，居所有天然色素之首，故可用马桑蚕沙来提取叶绿素。由于叶绿素易溶于丙酮、乙醇的脂性溶剂，故可用乙醇、丙酮溶液来提取。把提取出来的叶绿素制备成叶绿素铜钠盐，其性质更稳定，溶解性也更好。叶绿素分子中的镁原子和四个吡咯上的氮原子相结合，环上是双羧酸的酯，故可以发生皂化反应生成钠盐：

C55H72O5N4Mg+2NaOH→C34H30O5N4MgNa2+CH3OH+C20H39OH

C55H70O6N4Mg+2NaOH→C34H28O6N4MgNa2+CH3OH+C20H39OH

在酸性条件下，叶绿素钠盐分子中的镁极易被氢原子取代生成褐色的叶绿酸：

C34H30O5N4MgNa2+4H+=C34H34O5N4+Mg2++2Na+

C34H28O6N4MgNa2+4H+=C34H32O6N4+Mg2++2Na+

叶绿酸可与铜盐在加热条件下生成叶绿素铜酸析出，将叶绿素铜酸溶于丙酮，再与碱反应生成叶绿素铜钠盐：

C34H34O5N4+Cu2+=C34H32O5N4Cu+2H+

C34H32O6N4+Cu2+=C34H30O6N4Cu+2H+

C34H32O5N4Cu+2NaOH=C34H30O5N4CuNa2+2H2O

C34H30O6N4Cu+2NaOH=C34H28O6N4CuNa2+2H2O

1.2.2 方法

1.2.2.1 叶绿素的提取

在500 mL圆底烧瓶中，先加入50 g马桑蚕沙，加入搅拌子，再加入95%乙醇300 mL。

圆底烧瓶放在恒温磁力搅拌水浴锅中加热，水浴温度75 ℃，回流提取3 h，滤出提取液。

提取液使用旋转蒸发仪在55 ℃下蒸出乙醇，收集150 mL乙醇后停止旋蒸，剩余液体为叶绿素提取溶液。

1.2.2.2 皂化

向叶绿素提取溶液中加入5%NaOH-乙醇溶液25 mL，放入恒温磁力搅拌水浴锅中，在60 ℃下皂化回流90 min。

1.2.2.3 萃取

将皂化液冷却后转入500 mL分液漏斗加入100 mL石油醚萃取除去杂质，静置分层，下层为可溶性叶绿酸盐，取下层溶液，上层溶液用旋转蒸发仪蒸发回收石油醚，平行萃取3次。

1.2.2.4 调酸铜代

将下层溶液装入三口烧瓶中，先加入一定量的水(加水量∶皂化液=1∶7)，然后往其中慢慢加入6 mol/L盐酸溶液调节pH值为7，加入10%的硫酸铜2 mL，搅拌均匀后，再用盐酸将溶液调节pH为2～3，在60 ℃水浴中保温搅拌1 h。

趁热过滤，滤渣先用水洗去，再用95%乙醇洗涤3次后抽干。合并滤液和洗液，加入等量的蒸馏水，析出叶绿素铜，静置4 h后过滤，滤饼依次用适量的纯水、30%乙醇及石油醚洗涤3次至石油醚层变为浅绿色，以除去其中的H+及残留的叶黄素和其他有机杂质。

1.2.2.5 成盐

洗涤结束后滤干，滤饼用丙酮溶解，搅拌，成盐(用滤纸法检验成盐情况：用玻棒点少许溶液放在滤纸上，滤纸不显绿色则说明完全成盐)，将其在60 ℃下加热蒸发以除去水分得墨绿色结晶物，然后再在60 ℃下烘箱中烘干结晶物，即制得墨绿色光泽的成品(略有胺味)。

2 结果与讨论

2.1 叶绿素提取工艺条件筛选

2.1.1 提取溶剂类别

叶绿素的提取溶剂大多数采用丙酮和乙醇进行提取[4-19]，选择100%丙酮、95%丙酮、90%丙酮、100%乙醇、95%乙醇、90%乙醇进行试验，结果如图1所示，95%乙醇为提取溶剂时，提取效果最佳，从经济效益角度考虑，乙醇的价格比丙酮低，选择95%乙醇为提取溶液成本更低，从对人体的危害方面考虑，乙醇的毒性比丙酮小，所以最终选择95%乙醇为提取马桑蚕沙中叶绿素的提取溶剂。

图1 不同溶剂对叶绿素提取率的影响Fig.1 Effect of different solvents on the extraction rate of chlorophyll

2.1.2 提取溶剂用量

称取50 g蚕沙，分别加入95%乙醇150 mL、200 mL、250 mL、300 mL、350 mL、400 mL进行试验，并计算出叶绿素的提取率，结果如图2所示。当加入提取溶剂在300 mL以下时，叶绿素的提取率随着提取溶剂加入体积的增加而不断增加，当提取溶剂达到300 mL以后，叶绿素的提取率基本保持不变。说明此时马桑蚕沙中的叶绿素与溶剂中的叶绿素含量达到了平衡，继续增加提取溶液也不会再增加叶绿素的提取率。因此，提取溶剂选择加入300 mL为最佳。

图2 不同体积的提取溶剂对叶绿素提取率的影响Fig.2 Effect of different extraction solvent volume on the extraction rate of chlorophyll

2.1.3 提取温度

提取温度对叶绿素提取率的影响如图3所示，在60～75 ℃时，随着温度的不断升高，叶绿素的含量不断增加；当温度超过75 ℃后，随着温度的提高，叶绿素的含量开始逐渐下降，这个可能是因为叶绿素热敏感性导致的，温度太高加快了叶绿素的分解，使提取率逐渐下降。因此，选择75 ℃为最佳提取温度。

图3 提取温度的选择Fig.3 Selection of extraction temperature

2.1.4 提取时间

提取时间对叶绿素提取率的影响如图4所示，在1～3 h时，随着时间的不断增加，叶绿素的含量也不断的增加；当提取时间超过3 h后，叶绿素的含量又开始逐渐下降，这是因为提取时间太长叶绿素分解导致的。因此，选择3 h为最佳提取时间。

图4 提取时间的选择Fig.4 Selection of extraction time

2.2 叶绿素皂化工艺条件选择

叶绿素在蚕沙中，大部分与蛋白质形成复合的叶绿素体，通过皂化，使叶绿素转化成水溶性的叶绿素钠盐。皂化过程中，碱的用量太少或皂化时间太短会造成叶绿素皂化不完全，影响产率；碱用量太多或皂化时间太长又会造成资源浪费，增加生产成本。选择不同的加碱量和不同的皂化时间进行试验，通过加入石油醚观察，醚层颜色呈黄色，分界面清晰，表明皂化完全。表1表明，从节约成本和时间的角度出发，选择加入5%氢氧化钠乙醇溶液至25 mL，在60 ℃的水浴锅中皂化90 min，即可皂化完全。

表1 皂化条件的选择Tab.1 Selection of saponification conditions

2.3 铜代反应工艺条件选择

2.3.1 铜代反应加水比例优选

铜代时皂化液中乙醇浓度太高或太低都会影响产率，浓度太高硫酸铜不易溶解，铜代不完全；浓度太低，铜代生成的叶绿素铜酸会被析出，造成损失。乙醇浓度可通过加水量来控制，通过试验，结果如图5所示，加水量与皂化液体积比在1∶4到1∶7之间时，叶绿素铜钠盐的产率不断提高；加水量与皂化液体积比在1∶7到1∶8之间时，叶绿素铜钠盐的产率基本保持不变；加水量与皂化液体积比在1∶8到1∶10之间时，叶绿素铜钠盐的产率又开始下降，从节约成本的角度出发，最后选择加水量与皂化液体积比为1∶7时为最佳加水量。

图5 加水量的选择Fig.5 Selection of amount of water added

2.3.2 铜代反应pH值优选

铜代反应前先将皂化液pH值调至7，防止加入硫酸铜溶液后产生Cu(OH)2和 Mg(OH)2沉淀，加入硫酸铜溶液后再调节pH值进行铜代反应。pH值会直接影响铜代反应的进行，铜代反应是否完全决定着叶绿素铜钠盐的产率。pH值太高，不能生成叶绿素酸，无法进行铜代反应，pH值太低生成的叶绿素酮酸会再次转化成油状的叶绿素酸，造成损失。选择不同的pH值条件进行试验，结果如图6所示，选择pH为2～3时叶绿素铜钠盐的产率最高。

图6 pH值的选择Fig.6 Selection of pH value

2.4 工艺分析方法

2.4.1 用前述已经优化的各个工艺条件，进行全优化条件试验，得到产品，产品均为墨绿色带金属光泽的物质，略带氨味，易溶于水，微溶于乙醇、氯仿、甲醇，不溶于石油醚、丙酮、正己烷，其水溶液鲜绿翠亮。

2.4.2 对产品采用下列方法进行分析，分析该工艺条件下叶绿素铜钠盐粗产品的光谱特征、纯度以及产出率(相对于蚕沙原料重量)。

2.4.2.1 光谱特征

分别称取 0.0300 g叶绿素铜钠盐对照品和0.1200 g产品，用蒸馏水溶解在50 mL的容量瓶中，取出0.10 mL稀释至10 mL，用分光光度计在320～1100 nm波长下进行光谱扫描，得到如图7所示的光谱图。叶绿素对铜钠盐对照品和产品均在405 nm和627 nm左右有吸收峰，可判断所制得的产品均含有叶绿素铜钠盐。通过光谱图可以看出产品在350 nm处有吸收，区别于叶绿素铜钠盐对照品，这可能是因为产品含有杂质干扰的原因。

图7 叶绿素铜钠盐对照品(上)和产品(下)光谱图Fig.7 Spectra of sodium copper chlorophyll reference substance(top) and product(bottom)

2.4.2.2 产品纯度

分别称取0.0300 g左右的叶绿素铜钠盐对照品和产品，用蒸馏水溶解在50 mL的容量瓶中，取出0.10 mL稀释至10 mL，用分光光度计在405 nm处测其吸光度。通过比较叶绿素铜钠盐对照品和产品的吸光度，计算出产品的纯度。

可知叶绿素铜钠盐对照品的纯度为98.0%，取0.0302 g配制成溶液，其吸光度A405=0.3842，所以可以得到公式：

y=0.1298mx

其中，y为吸光度，A；x为叶绿素铜钠盐的纯度，%；m为称取样品质量，g；0.1298为换算系数。

产品纯度如表2所示，产品平均纯度为24.3%。

2.4.2.3 产品产出率

将采用全优化条件试验所得的产品进行称量，根据计算公式：

计算出产品的产出率，结果如表2所示，产品的平均产出率为2.10%。

表2 叶绿素铜钠盐对照品和产品的吸光度、纯度及产出率Tab.2 Absorbance，purity and yield of sodium copper chlorophyll reference substance and product

续表2

3 结论

这篇论文针对马桑蚕沙中富含叶绿素的这一特性，进一步开发利用，用于制备叶绿素铜钠盐粗品。用前述已经优化的各个工艺条件，进行10次全优化条件试验所得到的产品均为墨绿色带金属光泽的物质，略带氨味，易溶于水，微溶于乙醇、氯仿、甲醇，不溶于石油醚、丙酮、正己烷，其水溶液鲜绿翠亮，产品纯度在23.5%～24.8%之间，产出率在1.96%～2.26%之间。该工艺可适用于采用马桑蚕沙为原料制备叶绿素铜钠盐粗产品中，为发展马桑相关产业提供技术支撑。