中耳黏膜的扫描电镜样品制备方法的改进

首都医科大学中心实验室（100069）姬曼 赵君朋

扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscope，SEM）具有分辨率高、视野大、景深长和立体感强等优势，SEM既可以在低放大倍数下观察样品整体的三维结构，也可以通过高倍放大研究样品表面超微形貌特点，因此SEM是研究组织细胞表面微细结构研究的一种必不可少的工具[1]。中耳（听泡）解剖位置深邃，位于颞骨岩部，中耳黏膜上皮起源于内胚层，附于周围骨或软骨组织表面，腔内的立体结构错综复杂[2][3]。由于黏膜层薄而骨组织较厚且细胞的含水量不同，样品制备过程中组织收缩性不同，骨组织脱水变脆，极易发生形变损毁，从而导致附着黏膜层断裂和细胞表面的变形失真[3]。因此，对中耳黏膜组织进行大视野、立体结构观察时，保持组织完整性是困扰SEM工作者的棘手问题。本研究尝试在样品制备环节引入脱钙处理，取得了比较理想的效果，现介绍如下。

1 材料与方法

1.1 标本取材 3只健康SD大鼠（体重250～300g），称重后腹腔内注射6%水合氯醛（30mg/kg）麻醉，经鼓膜注入2.5%戊二醛1～2ml后断头处死动物，取出听泡。

1.2 扫描电镜标本的制备 分别用两种方法处理组织块：①正常对照组：样品用缓冲液冲洗黏液和血迹后，2.5%戊二醛固定6h，在解剖镜下分离得到咽鼓管和鼓室部位组织，入1%四氧化锇固定1h，然后依次经50%、70%、80%、90%、95%和100%乙醇梯度脱水，每次5min；最后放入临界点干燥仪中，处理1.5h；干燥后的样品粘于样品台上，经离子溅射仪镀膜，于扫描电子显微镜下观察并记录。②脱钙处理组：样品用缓冲液冲洗黏液和血迹后，首先2.5%戊二醛固定6h，在解剖镜下分离得到咽鼓管和鼓室部位组织，置10%EDTA溶液中（4℃）脱钙处理12h，后续处理同对照组。……