基于网络药理学研究健脾固肠方治疗结肠癌的作用机制＊

陈中怡，李 芸，周张杰，吴婷婷，付淑娟，钟 薏＊＊，杨 铭，陈 健，王治英

（1.上海市虹口区欧阳路街道社区卫生服务中心 上海 200081；2.上海中医药大学研究生院 上海 201203；3.上海市中西医结合医院 上海 200082；4.上海中医药大学附属龙华医院 上海 200032；5.天津中医药大学中医学院 天津 301617）

结肠癌是是常见的恶性肿瘤之一。2018年的全球癌症数据报告[1]显示，结肠癌已成为发病率前三的癌症之一，其死亡率排名第二。由于基因表达模式多变，很多调控机制尚有待研究，西医并未明确结肠癌的发病机制。目前已有三种学说：腺瘤-癌变学说、肿瘤干细胞假说和炎症学说。对于未转移的结肠癌，主要通过外科手术治疗；无法手术的则采用内科放化疗或放化疗结合手术治疗、基因治疗、分子靶向药物治疗、生物免疫学治疗等。但西医治疗仍有一定局限性，许多患者无法耐受在疗效收益同时带来的不良反应。

中医古籍中并未确切提到结肠癌这一名词，但在古籍中能找到大量与现代大肠癌症状体征、病因病机类似的病名，早在《黄帝内经》中就有相关记载，如《灵枢·刺节真邪篇》中云： “有所结，气归之，卫气留之，不得反，津液久留，合而为肠溜” 。现代将大肠癌归属于中 医 “便血” “肠风” “积聚” “脏毒” “肠蕈” “锁肛 痔” 等范畴。现代中医在古人的基础上，在治疗结肠癌以及改善结肠癌伴有的便秘、腹泻、腹痛、便血等症状上取得了长足发展，提高了患者的生存质量。祖国传统医学治疗结肠癌的宝库亟待发掘。

健脾固肠方是上海市中西医结合医院钟薏主任在临床治疗结肠癌中总结出的经验方。健脾固肠方的 “前身” 扶正健脾方已经通过动物实验证实能够降低PI3K、AKT蛋白的表达，抑制PI3K-AKT信号通路，从而减少肠癌侵袭及转移微环境的形成，减少结肠癌复发及转移的可能性[2]。前期关于健脾固肠方的临床研究和动物实验已经证实，健脾固肠方能够减少肠道粘膜通透性、抑制肠道炎性反应[3]、保护肠道屏障[4]、调节肠道免疫平衡[5]，能改善结肠癌引起的不适主诉，减少结肠癌的转移及复发，提高结肠癌患者的长期生活质量。

由于健脾固肠方组成药物多、成分复杂，其治疗结肠癌的作用机制尚不完全明确。而网络药理学是一门通过设立信号节点搭建网络，进一步分析网络阐述疾病过程与药物对机体作用，从而研究药物作用机制的新兴学科。近年来网络药理学在筛选中药活性化合物、预测中药作用靶点、阐述方药作用机制等中医药研究中起着重要作用。

本研究通过网络药理学研究，尝试探讨健脾固肠方治疗结肠癌的作用机制。PI3K是健脾固肠方的前身扶正健脾方的作用靶点，同时是PI3K-AKT信号通路的上游，且前期发现能够能减轻肠道炎症[3]，故通过体外实验研究验证健脾固肠方及其关联度最高的潜在活性化合物棕榈酸对PI3K、AKT蛋白与IL-6炎性因子的影响，为健脾固肠方的临床应用、新适应症开发以及治疗结肠癌的新药研发提供一定思路。

1 材料与方法

1.1 网络药理学部分

1.1.1 筛选活性成分和靶蛋白

本研究通过检索CINTMED、TCMID、TCMSP、HIT、STITCH数据库，以QED大于0.2[6]作为筛选原则，通过TCMSP、PubChem、ChEMBL数据库以及查阅相关文献得到化合物的化学结构。

通过TCMID、TCMSP、HIT、STITCH数据库进行活性化合物的靶点预测。TCMID、HIT以RV大于0.8作为筛选指标，TCMSP以RFA大于0.8、AVM大于0.7作为筛选指标，STITCH以Medium confidence 0.400作为筛选指标[7]。

1.1.2 结肠癌的相关靶点搜集

通过检索MalaCards、HGMD、OMIM、TTD、DrugBank以及查阅相关文献，整理得到结肠癌的疾病靶点数据库。

1.1.3 中药-化合物-靶点-疾病网络构建

将复方潜在作用靶点和结肠癌靶点信息分别导入STRING构建PPIN。并利用Cytoscape 3.7.2[8]建立健脾固肠方中药-化合物-靶点-疾病网络图。

1.1.4 构建靶点相互作用网络

通过Network Analyzer对其进行网络分析，先以Degree的2倍中位数筛选出核心网络，再根据Degree中位数、Closeness中位数、Betweenness中位数筛选出结肠癌关键靶点相互作用网络[9]，再利用Merge将两者合并，筛选出健脾固肠方结肠癌共同关键靶点相互作用网络。

1.1.5 KEGG信号通路和GO生物过程富集分析

将采集筛选得到的健脾固肠方潜在作用靶点分别导入GO、KEGG数据库，采用超几何分布模型P值评估GeneSet与基因本体是否显著关联，并使用Bonferroni Corrected[10]调整的P值（P.adjust）反映靶点与基因本体的关联强度，以P.adjust<0.01为显著关联，得到GO富集及KEGG信号通路。

1.2 实验部分

1.2.1 药物制备与试剂

健脾固肠方颗粒剂（江阴天江药业有限公司，批号：1709320）；棕榈酸（Sigma，批号：SLBM8964N）；氢氧化钠（Richjoint，批号：20190310JN）；脱脂牛血清白蛋 白（Bio-Light Biotech，批 号：BSA081022）；PBS（Basal Media，批号：C210702764）；0.4%台盼蓝染液（Noblebio，批号：2019070500）；DMEM培养基（Giboc，批号：2120374）；胎牛血清FBS（Giboc，批号：1828728）；CCK8试剂盒（Sangon Biotech，批号：E606335-0500）；EDTA胰酶（Giboc，批号：25200-072）；PI3 Kinase p110βRabbit mAb（CST，批 号：3011S）；Phospho-PI3 Kinase ClassⅢ（Ser249）Antibody（CST，批号：13857S）；Goat Anti-Rabbit IgG二抗HRP（Abbkine，批号：A21020）；Goat Anti-Mouse IgG（Abbkine，批 号：A21010）；Anti-β-Actin Mouse Monoclonal Antibody（Abbkine，批号：A01010）等。

将10只SD大鼠随机分成空白组和中药组，空白组2只，中药组8只。中药组按相当于70 kg成年人105 g中药的剂量，即9.45 g·kg-1剂量对大鼠灌胃，空白组大鼠按重量灌胃等体积的超纯水，每天灌胃1次，连续灌胃10日。在第10日灌胃后2 h，对大鼠进行心脏取血，以4℃、2000 rpm离心10 min后提取血清，除菌后以-80℃冷冻存放。所有SD大鼠购买于上海西普尔-必凯实验动物有限公司，许可证号码：SCXK（沪）2018-0006，合格证编号：20180006008347，饲养于上海市中西医结合医院脉管病研究所。

1.2.2 分组和药物干预

分为健脾固肠方含药血清组、空白血清组和棕榈酸组。含药血清组和空白血清组分别再设20%组、15%组、10%组和5%组[11]。棕榈酸组再设500μM组、250μM组、125μM组、62.5μM组、31.25μM组、15.63 μM组、7.81μM组、3.91μM组、1.95μM组和0μM组[12]，并另设对照组和空白对照组。

1.2.3 细胞培养传代

SW480细胞由上海中医药大学科技实验中心分子生物与药理实验室吴中华老师惠赠。将细胞悬液加入10 cm皿中，同时加入8 mL培养基培养过夜，直至检测细胞密度达到80%时进行传代培养。

1.2.4 CCK8法

在96孔板上以每孔5×103个细胞接种，设4个复孔，按照2.4分组和药物进行干预。在每个复孔中加入10μLCCK8试剂，将孔板放入培养箱中孵育45 min，用酶标仪在450 nm波长处测定光密度（Optical density，OD）值。

1.2.5 Western Blot法

测定蛋白浓度并计算蛋白上样量。将蛋白样品分别加入10%和5%的凝胶中电泳，转膜，5%脱脂牛奶于室温条件下摇床封闭2 h，按照1∶1000加入一抗，4℃孵育过夜。第2日1×TBST充分洗膜（5 min×3），加入二抗（1∶2000），1×TBST充分洗膜（5 min×3），ECL发光显影。

1.2.6 化学发光法

收集细胞上清液，将上清液和生物素标记抗体，三联吡啶钌标记抗体加入一次性反应杯，37℃孵育10 min。加入联袂亲和素包被的磁珠，37℃孵育10 min。加入三丙胺激发缓冲液，检测相对光子强度（Relative light units，RLU）。通过标准品的RLU简历标准曲线，定量测出IL-6的含量。

1.2.7 统计学方法

采用SPSS 27.0软件进行单因素方差分析，当Levene方差齐性检验显示方差齐时，采用LSD法进行两两比较，以P值小于0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 网络药理学部分

2.1.1 健脾固肠方候选化合物和对应人类靶点筛选结果

健脾固肠方8味中药中，黄芪有36个活性化合物，党参有30个活性化合物，茯苓有7个活性化合物，白术21个活性化合物，土茯苓有20个活性化合物，菝葜有13个活性化合物，预知子有3个活性化合物，藤梨根有2个活性化合物，共有102个潜在活性化合物，30个活性化合物在不同中药中重叠。通过Network Analyzer对其进行网络分析，表1展示了结果中Degree值大于1的部分，通过分析可得全方关联最多潜在活性化合物为棕榈酸（palmitic acid，c175）。

表1 健脾固肠方中药-活性化合物网络分析及其拓扑学特征

2.1.2 构建中药-活性化合物-潜在作用靶点网络及蛋白质互相作用网络

健脾固肠方共得到潜在作用靶点481个，将结果导入Cytoscape 3.7.2通过Network Analyzer对其进行网络分析，筛选出关键节点51个（表2、图1）。

表2 健脾固肠方关键靶点及其拓扑学特征

2.1.3 人结肠癌蛋白质互相作用网络

共筛选出572个结肠癌疾病靶点，去重合并整理后共得到517个疾病靶点（图2）。将结果导入Cytoscape 3.7.2通过Network Analyzer对其进行网络分析，筛选出关键节点25个（表3）。

表3 结肠癌关键靶点

图2 结肠癌靶点互相作用网络

2.1.4 健脾固肠方-结肠癌互相作用网络

建立复方-疾病共同PPIN（图3）。利用Cytoscape 3.7.2中Merge得到疾病与复方4个共同关键靶点（表4）。

图3 结肠癌与健脾固肠方靶点互相作用网络

表4 结肠癌与健脾固肠方共同关键靶点

2.1.5 GO富集分析

共富集得到基于MF 153条疾病GO途径和176条复方GO途径，基于BP 2479条疾病GO途径（图4）和2318条复方GO途径（图5），基于CC 82条疾病GO途径和98条复方GO途径（图6）。综合GO富集分析显示，健脾固肠方潜在作用靶点和疾病靶点在GO水平上显示出共关联性，复方与疾病基因共关联GO相似度达61.57%，主要与细胞的增殖、分化和凋亡、转录、信号转导、跨膜运输等有关。

2.1.6 KEGG信号通路富集分析

分析得到复方与疾病共关联信号通路54条（图7），其中PI3K-AKT信号通路（图8）、肿瘤坏死因子信号通路（图9）、细胞凋亡（图10）与3个共关联靶点有关。复方与疾病基因共关联KEGG信号通路相似度72.00%。

图9 肿瘤坏死因子信号通路

图10 细胞凋亡

2.2 实验部分

2.2.1 健脾固肠方含药血清及棕榈酸对SW480细胞增殖的影响

研究结果表明，健脾固肠方含药血清干预24 h，在5%低浓度范围时，能够促进SW480细胞增殖（图11）；在10%到20%较高浓度范围时，能够抑制SW480细胞增殖，且呈浓度依赖性，通过单因素方差分析比较不同浓度含药血清与同浓度空白血清OD值发现（图12），15%浓度含药血清与同浓度的空白血清相比，差异具有统计学意义（P<0.05）；20%浓度含药血清与同浓度的空白血清相比，差异具有统计学意义（P<0.01）。

图12 不同浓度含药血清、空白血清、培养基干预24 h的OD值

研究结果表（图13-图14）明，棕榈酸干预24 h，在0μM-62.5μM低浓度范围内能够促进SW480细胞增殖；在125μM-500μM高浓度范围内能够抑制SW480细胞增殖。棕榈酸干预48 h，在0μM-62.5μM低浓度范围内同样能够促进SW480细胞增殖，在125μM-500μM高浓度范围内能够抑制SW480细胞增殖。

图13 不同浓度棕榈酸分别干预24 h、48 h对SW480细胞的抑制率

图14 不同浓度棕榈酸分别干预24 h、48 h的OD值

2.2.2 健脾固肠方含药血清和棕榈酸干预SW480细胞后PI3K和AKT蛋白的表达

研究结果表明（图15-图16），与对照组相比，含药血清组和棕榈酸组能降低SW480细胞中PI3K的蛋白表达，但与对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05）；空白血清组中PI3K蛋白表达升高，但与对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05）。与空白血清组相比，含药血清组能降低PI3K蛋白的磷酸化，差异有统计学意义（P<0.01）；与对照组相比，棕榈酸组能降低PI3K蛋白的磷酸化，差异有统计学意义（P<0.05）。

图15 各组药物干预24 h对SW480细胞中PI3K蛋白的表达

图16 各组药物干预24 h对SW480细胞中p-PI3K蛋白的表达

研究结果表明（图17），与空白血清组相比，含药血清组能降低AKT总蛋白的表达，差异有统计学意义（P<0.01）；与对照组相比，棕榈酸组能降低AKT总蛋白的表达，差异有统计学意义（P<0.01）。与空白血清组相比，含药血清组能降低AKT蛋白的磷酸化，差异有统计学意义（P<0.01）；与对照组相比，棕榈酸组能降低AKT蛋白的磷酸化，差异有统计学意义（P<0.01）。

图17 各组药物干预24 h对SW480细胞中AKT、p-AKT蛋白的表达

2.2.3 健脾固肠方含药血清和棕榈酸干预SW480细胞后对IL-6含量的影响

研究结果表明（图18），与空白血清组相比，含药血清组能降低SW480细胞中IL-6浓度，差异有统计学意义（P<0.01）；与对照组相比，含药血清组能升高IL-6浓度，差异有统计学意义（P<0.01）；与对照组相比，棕榈酸组能升高SW480细胞中IL-6浓度，差异有统计学意义（P<0.01）；与对照组相比，空白血清组中IL-6浓度升高，差异有统计学意义（P<0.01）。

图18 各组药物干预24 h SW480细胞中IL-6的浓度

3 讨论

结肠癌临床表现通常有便秘、腹泻、腹痛、腹胀、不思饮食、恶心呕吐、精神倦怠、寡言少语等，通过大量临床病例的经验总结，以四君子汤为基础，拟出的健脾固肠方[13]，全方共黄芪、党参、茯苓、白术、土茯苓、菝葜、预知子、藤梨根8味药。全方以黄芪补气益卫、固表止汗、托疮生肌、利水消肿，能够促进肠道粘膜修复、减轻肠道炎症反应[14]，党参、茯苓、白术共同作用，加强补益脾胃正气，健脾和胃，减少对肠道粘膜的刺激，修复肠道粘膜的损伤[15-17]，土茯苓、菝葜、藤梨根化湿解毒[18-20]，预知子疏肝理气、和胃调中、活血化瘀、软坚散结、抑癌扶正[21]。健脾固肠方全方用药平和，温凉兼备、补泻兼施，补以补气健脾，泻以化湿化瘀，补中有泻，泻中有补，调和阴阳。前期临床研究已经表明，健脾固肠方能够通过抑制肠道粘膜通透性、肠道炎性反应，达到保护肠道屏障、调节机体免疫的功能，还能改善结肠癌引起的不适主诉，减少结肠癌转移或者复发的几率，提高结肠癌患病后的长期生活质量[4]。

通过Cytoscape 3.7.2软件分析健脾固肠方药物-活性化合物-靶点网络，得到健脾固肠方8味中药按网络中心性高低排序依次为黄芪、党参、白术、土茯苓、菝葜，基本符合君臣佐使的配伍原则，茯苓的网络中心度结果与其作为臣药的配伍规律不尽相符，可能需要今后进一步试验研究加以明确。

通过Cytoscape 3.7.2软件分析出健脾固肠方关联性最高的活性化合物为棕榈酸（palmitic acid，c175），可能是健脾固肠方治疗结肠癌最重要的物质基础，主要来自黄芪、党参、白术，表明黄芪、党参、白术在该方中具有不可撼动的地位。同时土茯苓、预知子、茯苓、菝葜、党参、黄芪、白术7味中药中均有棕榈酸，探索有效成分可以为进一步研究健脾固肠方的作用疗效提供新的方法，并且为优化方剂、开发新药提供方向。

通过PPIN分析，健脾固肠方关键靶点51个，结肠癌关键靶点25个，健脾固肠方与结肠癌共同关键靶点4个，分别为TP53、TNF、AKT1、IL6，棕榈酸对4个靶点均有作用。健脾固肠方活性化合物可能通过上调TP53表达，下调TNF、AKT1、IL-6表达达到治疗结肠癌的作用。

本次研究以人结肠癌SW480细胞为研究对象，采用CCK8法探讨健脾固肠方含药血清和有效单体棕榈酸对SW480细胞的增殖作用，实验结果验证了含药血清和棕榈酸在不同浓度下对人结肠癌细胞有增殖和抑制两种相反作用，浓度决定了作用的倾向性。中药中有效成分的浓度高低影响细胞生物学行为，如关于经方血府逐瘀汤的研究表明，低浓度（<10%）含药血清能促进大鼠主动脉平滑肌细胞增殖和迁移、侵袭，反之高浓度（>10%）含药血清则有抑制作用，其作用可能与上清液的NO含量水平有关[22]。健脾固肠方含药血清也表现了相同的趋势，在低浓度时有促进肿瘤细胞增殖的作用，而在高浓度时具有抑制肿瘤细胞增殖的作用，可能与血清中的含药成分浓度高低有关。而低浓度棕榈酸对肿瘤有促进作用，高浓度对肿瘤有抑制作用，与文献查阅结果基本一致[23-26]。作用倾向取决于浓度的现象，可能提示了临床上健脾固肠方宜浓煎服用。

由于健脾固肠方前身 “扶正健脾方” 能显著抑制PI3K和AKT的表达，故此次选择PI3K和AKT作为靶蛋白验证。在选择抑制肿瘤细胞增殖的半抑制浓度后，发现含药血清和棕榈酸都降低SW480细胞中PI3K蛋白和AKT蛋白的磷酸化表达，结肠癌是一种由多因素导致、多基因参与、多阶段发生的疾病，结肠肿瘤细胞的活动与信号通路中蛋白质异常磷酸化有关[27]。

在选择抑制肿瘤细胞增殖的半抑制浓度后，发现空白血清、含药血清及棕榈酸均能升高SW480细胞中IL-6的浓度。考虑原因可能是大鼠血清和人结肠癌SW480细胞为异体血清，诱发了炎症反应，导致IL-6浓度升高；含药血清较空白血清能降低IL-6浓度，说明健脾固肠方可能通过下调IL-6浓度，抑制PI3KAKT信号通路，从而减少肿瘤细胞的转移与侵袭[28]；棕榈酸较空白血清能升高IL-6浓度的原因尚不明确，初步考虑可能与高脂环境诱发细胞炎症以及IL-6具有双向调节作用有关[29]，今后将进一步研究。此外，健脾固肠方中党参、茯苓、白术、土茯苓、菝葜都对醇溶性浸出物有检测要求，今后可进一步行质谱分析了解复方中棕榈酸及其催化反应中间产物、代谢产物的含量。