大孔树脂分离纯化虎杖白藜芦醇和蒽醌类成分的工艺优化

骆 航，孙兴力，李华生，周振华，李玉婷

（永州职业技术学院医学院，湖南 永州425100）

虎杖是一种天然药物资源，其嫩叶可做蔬菜食用，嫩茎口感松脆爽口，性似竹笋，被称之为虎杖笋，根煮熟可做冷饮，具有清凉解暑的功效，地下根及根茎亦是一种中药材。虎杖含有两类重要的化学成分，即白藜芦醇和蒽醌［1］，特别是其中的白藜芦醇在食品、医药和化工等领域都是重要中间原料，具有很高的应用价值［2-4］。早些年对虎杖的开发应用主要集中在某单一化学成分或化学部位上，对虎杖化学成分的综合开发和利用研究较少，使得我国丰富的虎杖资源的工业价值未能得到充分发挥和体现。目前虎杖化学成分开发利用的难点主要是将不同成分类型的提取物进行分离和纯化。

大孔吸附树脂是一种广泛用于中草药化学成分分离和富集的高分子材料，因其具有良好的稳定性和选择性，分离速度快，吸附容量大，操作方便，可再生使用等诸多优点［5］，迅速成为柱层析中常用的分离介质。为充分保留虎杖中的活性成分，提高虎杖提取物的附加值，采用大孔树脂分离纯化虎杖提取物中的白藜芦醇和蒽醌类化合物具有很强的现实需求。但是大孔树脂类型繁多，尚需对不同类型大孔树脂的各项参数和应用条件进行考察，才能寻找出最佳的分离纯化工艺。本实验在对虎杖中白藜芦醇和蒽醌类化合物提取工艺确定的基础上，以白藜芦醇、总蒽醌的含量为考察指标，对两大活性成分的大孔树脂分离纯化工艺进行优化研究，为综合开发利用虎杖资源奠定基础。

1 仪器与试药

Agilent1260高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；UV-2201SHIMADZU型分光光度计（日本岛津）；KQ2200超声波清洗器（上海楚定分析仪器有限公司）；TDL80-213离心机（上海安亭科学仪器厂）；气浴恒温振荡器（江苏金坛市医疗仪器厂）；FY130型药物粉碎机（天津泰斯特仪器公司）；RE-3000A型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；AE240型电子分析天平（瑞士METTLER）。

白藜芦醇对照品、大黄素对照品、大黄素甲醚对照品（购自中国食品药品检定研究院，批号分别为111535-201703、110756-201913、110758-201616）；虎杖药材（购自湖南廉桥药材市场，由湖南中医药大学中药鉴定教研室潘清平教授鉴定）；植物精提复合酶（宁夏夏盛实业集团有限公司）；AB-8，NKA-9，NKA-2，D101，H103型大孔树脂（天津南开大学化工厂）；甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂除乙醇外均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 虎杖样品溶液的制备

虎杖粗粉参照文献［6］的方法进行酶发酵处理，称取酶处理过的虎杖粗粉约100 g，加入70%的乙醇1000 mL，超声提取1 h（功率250 W）。过滤，滤液减压浓缩至无醇味，离心，沉淀加水分散，离心取上清液，重复操作1次。将上清液合并，加水定容至1000 mL的容量瓶中，摇匀，得1 mL相当于药材0.104 g的虎杖样品液。

2.2 含量测定方法

白藜芦醇、虎杖总蒽醌的含量分别按文献［7］中的高效液相色谱法进行测定。

2.3 大孔吸附树脂的筛选

2.3.1 静态饱和吸附量测定试验 参考相关文献，选AB-8、NKA-9、NKA-2、D101、H103型5种大孔树脂［8-14］，树脂经过预处理之后［15］，各称取2.5 g，置于具塞三角瓶中，分别精密加入样品溶液50 mL，置于振荡器中（室温，频率80 r/min，下同）振摇12 h，充分吸附后，取滤液，按2.2项的方法测定白藜芦醇和蒽醌的浓度，并按公式计算出各树脂的吸附量。

吸附量（mg/干树脂）=吸附量/上样量=（C前V前－C后V后）/W。其中，C前，C后分别为吸附前、后指标成分浓度；V前，V后为上样液吸附前、后溶液的体积；W为树脂质量（g）。结果见表1。

表1 5种不同树脂静态饱和吸附结果 （mg/g）

2.3.2 静态洗脱率测定试验 将已经静态饱和吸附有效成分后的5种大孔树脂AB-8、NKA-9、NKA-2、D101、H103，过滤，风干水分，精密加入70%乙醇50 mL，置振荡器中，振摇解吸12 h后，过滤，测定洗脱液中各物质浓度，按公式计算出各种大孔树脂的静态洗脱量和洗脱率。结果见表2。

洗脱率（%）=解吸量／吸附量=C解V解/（C前V前－C后V后）。其中，C解、V解为解吸后指标成分浓度与液体体积。结果见表2。

表2 5种不同树脂静态洗脱结果 （mg/g）

2.4 静态动力学试验

2.4.1 静态吸附动力学测定 精密称取2 g经预处理的H103型大孔树脂，置于100 mL三角瓶中，加入虎杖样品液50 mL，置振荡器中振摇，每隔一段时间取出3 mL样品液，分别测定溶液中各指标成分的浓度，根据浓度吸附计算树脂的吸附量。以树脂吸附量Y（mg/g）对时间X（min）作图，得到H103树脂的静态吸附动力学曲线，见图1。如图1可知，随着时间的延长，样品液中有效成分的吸附量逐渐增加，白藜芦醇和蒽醌类成分在前4 h内吸附较快，并分别在5 h、7 h时接近完全吸附。但蒽醌成分在6 h后趋于平缓，从生产效率与成本方面综合考虑，本研究选择6 h作为虎杖提取物上柱液的静态吸附时间较为合适。

图1 白藜芦醇和蒽醌的静态吸附动力学曲线

2.4.2 解吸动力学测定 将吸附后的树脂抽滤出来，置于三角瓶中，加入70%的乙醇液50 mL，于振荡器中振摇，每隔一段时间取3 mL经解吸液，分别测定溶液中各指标成分的浓度，见图2。通过解吸动力学试验可知，随着时间的延长，样品液中有效成分的浓度逐渐增加，白藜芦醇和蒽醌分别在3 h、4 h时达到完全解吸。因此，在静态解吸试验中，有效成分在4 h左右基本达到了完全解吸。

图2 白藜芦醇和蒽醌的静态解吸动力学曲线

2.5 H103型大孔树脂的动态吸附试验

准确称取10 g经预处理的H103型大孔树脂，按湿法装入层析柱，取2.1项下制得的虎杖提取液300 mL（白黎芦醇质量浓度为0.198 mg/mL，蒽醌质量浓度为0.244 mg/mL）上柱。每10 mL收集流出的样品溶液1份，测定其指标成分浓度，绘制动态吸附曲线，见图3。

图3 白藜芦醇和蒽醌的动态吸附曲线

由图3可知，白藜芦醇在流份7的含量为流份6的9.88倍，表现出明显的泄漏现象；蒽醌在流份9的含量为流份8的6.30倍，此时蒽醌成分开始出现泄漏现象。按每段流份10 mL计算，综合考虑，总上样体积为60 mL较为合适，相当于6.2 g生药。表明每克H103型大孔树脂对虎杖的处理能力为0.62 g生药。

2.6 正交优选

H103树脂工艺参数试验在各单因素试验的基础上精密称取经预处理的H103型大孔树脂9份，根据样品溶液中白藜芦醇和蒽醌成分的理化性质结合大孔树脂的吸附特点，选择溶液浓度、pH值、流速作为考察因素，各因素选择3个水平，采用L9（34）正交表，实施正交试验设计，各因素水平的设计具体见表3。

表3 因素水平表

按表1的设计进行正交试验，并以白藜芦醇和蒽醌的吸附量作为试验指标，试验结果见表4。通过对表4的直观分析可知，4号试验方案的总吸附量最大，最佳的提取工艺是A2B1C2，即pH4、上样流速0.5 mL/min、原液浓度0.12 g（生药）/mL。通过方差分析可知，影响总吸附率的因素优先顺序为B〉A〉C，其中上样流速、原液的pH值对虎杖有效成分的吸附量有显著影响，而原液浓度对吸附量的影响较小。

表4 正交试验结果 （mg/g）

按优化后的工艺条件A2B1C2进行3次平行试验，结果见表5。在此条件下，测得H103型大孔树脂虎杖白藜芦醇和蒽醌的总吸附量分别为190.72 mg/g、192.09 mg/g和191.27 mg/g，说明此工艺条件稳定可行。

表5 验证试验结果 （mg/g）

2.7 洗脱溶剂的选择

精密称取经预处理过的H103型大孔树脂7份，每份1 g，分别置于三角瓶中，加入样品液后置于振荡器中，振摇使之充分吸附，然后将树脂抽滤出来，晾干，各树脂柱对应加入30%、40%、50%、60%、70%、80%、95%的乙醇各20 mL，室温下置振荡器振摇，让其充分解吸后，测定洗脱液中各指标成分的浓度，并根据浓度计算出洗脱率。乙醇的洗脱结果见表6。

表6 不同浓度乙醇洗脱作用比较

由表6可知，用70%乙醇洗脱时，白藜芦醇的洗脱率最高，用95%乙醇洗脱时蒽醌成分的洗脱率最高。50%以下的乙醇对两类成分的洗脱效果较差，70%或80%乙醇均能获得较好的洗脱效果，考虑到成本及脂溶性杂质也会随乙醇的浓度增加而增加，经综合考虑，故选定70%乙醇作为洗脱剂。

2.8 H103型大孔树脂的动态解吸试验

样品溶液按2.6项下正交试验筛选出的条件上柱吸附，先用一定量的去离子水洗至树脂流出液不浑浊。再以70%乙醇洗脱，每10 mL收集1份，共收集10份，每份取适量分别测定洗脱液中白藜芦醇和蒽醌成分的浓度。以每份收集液中各指标成分的含量为纵坐标，洗脱体积为横坐标绘制洗脱曲线。结果见图4。

由图4可知，白藜芦醇和蒽醌在洗脱至第6份体积时含量已经很低，当洗脱至第8份体积时含量已接近为0。所以最后确定每10 g树脂用80 mL洗脱剂。

图4 H103型大孔树脂的动态解吸曲线

2.9 H103型大孔树脂动态解吸流速的确定

分别准确称取5 g经预处理后的H103大孔树脂3份，按湿法装入层析柱，虎杖药材按已确定的工艺进行提取，提取液经浓缩、离心后按2.6项所确定的工艺上柱，经吸附饱和后，先分别用去离子水冲洗柱子至流出液无色，再以40 mL浓度为70%的乙醇，按0.5 mL/min、1 mL/min、2 mL/min的流速分别洗脱，收集流出液，分别测定各流出液中白藜芦醇和蒽醌的含量，并计算洗脱率。

不同洗脱流速对洗脱率的影响，见表7。由表7的结果可知，洗脱效果与洗脱流速成负相关性，当洗脱速度越快时，洗脱效果越低，特别是流速超过2 mL/min后，洗脱剂与树脂上的成分不能进行充分接触，洗脱效果明显变差。建议把流速控制在1mL/min左右，可以兼顾到洗脱得率和洗脱的效率。

表7 不同洗脱流速洗脱率比较

2.1 0 所得产品总有效成分的纯度测定

准确称取100 g已经处理过的H103型大孔树脂，按湿法装柱，再按上述最佳上样和洗脱条件，取100 mL虎杖样品溶液在H103型树脂柱上进行洗脱，收集洗脱液，低温烘干成粉末并干燥至恒重，粉末称重为1.9305 g。再取烘干粉末0.5002 g，分别按2.2项下方法测定各有效成分含量，每个样品重复3次，测定白藜芦醇平均含量为34.77%（34.23%、35.40%、34.68%），蒽醌含量为47.39%（47.85%、47.76%、46.55%），总有效部位的平均纯度为82.16%，较之大孔树脂纯化前的含量，纯度提高了5倍。

3 讨论

采用大孔吸附树脂对虎杖主要化学成分进行分离和纯化的研究已有不少文献进行过报道，通过对比发现，即便是虎杖中相同成分，不同文献筛选得到的最佳大孔吸附树脂类型和工艺并不完全一致。本研究通过对AB-8、NKA-9、NKA-2、D101、H103型5种大孔吸附树脂富集纯化虎杖白藜芦醇和蒽醌两大成分的性能进行考察，结果发现H103型大孔吸附树脂对上述两类虎杖成分具有较好的富集作用和良好的解吸效果。

对H103型大孔树脂进行正交试验，以原液的浓度、pH值、上样流速为因素进行上样条件考察，最后确定原液浓度为0.12 g/mL，原液pH值调整为4，上样液流速控制为0.5 mL/min时能获得最好的吸附效果，其中上样流速对吸附效果具有显著性影响。理论上来说上样液流速越慢，化学成分才能更有效地扩散到树脂内部和表面进行分子筛过滤，并依靠范德华力和氢键等发生物理吸附。过快的流速显然不利于树脂与被吸附成分的充分接触而导致泄露增加，产率下降。在实际生产操作中，需要尽量缩短吸附时间才能兼顾到生产效率。在大孔树脂的吸附过程中，药液的pH值影响也较为显著。白藜芦醇和蒽醌都属于酚性成分，具有一定的酸性，树脂对其吸附的能力很大程度上受到解离度的影响。即酸性条件下酸性物质主要以分子形式存在，易被树脂吸附，而在碱性条件下发生解离，则不易被吸附。但过低的pH值不但会影响白藜芦醇的稳定性，还会使白藜芦醇等转变成烊盐，导致吸附下降。因此，原液以控制在pH值4为宜。

另外，对H103大孔树脂洗脱条件进行考察，洗脱流速对洗脱率有一定影响，最终确定洗脱流速为1 mL/min，洗脱溶剂为70%乙醇。最后对所得产品的总有效成分进行纯度测定，测定结果显示纯化后虎杖总有效成分的含量可达80%以上，说明本工艺稳定可行。

虎杖活性成分除蒽醌和白藜芦醇外，尚含有白藜芦醇的苷类化合物，即虎杖苷。具文献报道，虎杖苷在植物中的含量比白藜芦醇要高数倍，但虎杖苷作为活性成分在体内要先转化为白藜芦醇才能发挥医疗作用。本研究对原料药材的预处理采用了酶解发酵的方法，即让苷类酶解成相应苷元，发现效果与直接使用虎杖原料提取比较白藜芦醇和游离蒽醌的含量可以提高数倍。酶处理不仅提高了有效成分产率，同时也有助于降低大孔树脂同时分离多种成分的工艺难度。

经H103大孔树脂富集后的白藜芦醇和蒽醌可采用醇提水沉、结晶等传统方法进一步分离。本实验对虎杖提取物大孔树脂的处理研究为以后将虎杖作为原料向中药制剂、保健用品的开发和工艺制定提供了科学依据，不失为一次有益的探索。