厚朴酚对脂肪酸诱导HepG2细胞脂质积蓄的作用及机制研究

钟艳花，林 重，钟映芹，唐东晖

（广州市荔湾区中医医院，广东 广州510140）

代谢相关脂肪性肝病（metabolism related fatty liver disease，MAFLD），曾用名非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除外酒精和其他明确的损肝因素所致的以肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征，与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关的获得性代谢应激性肝损伤，包括单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎及其相关肝硬化。随着肥胖及其相关代谢综合征全球化的流行趋势，代谢相关脂肪性肝病现已成为欧美等发达国家和我国富裕地区慢性肝病的重要病因，MAFLD患病率10%～30%，严重危害人民健康。但是由于MAFLD发病机制复杂，目前国内外对其发病机制仍不清楚，在一定程度上限制了MAFLD的临床治疗和药物开发。

藿朴夏苓汤组方源自《医原》，方由广藿香、厚朴（姜制）、半夏（制）、茯苓、杏仁、薏苡仁、白蔻仁、淡豆豉、泽泻和通草组成，具有理气化湿、疏表和中之功效，与NAFLD的病机特点相吻合，临床用于湿温初起湿重于热者，是临床常用治湿之良剂，广泛用于肝胆、胃肠道湿热证［1－5］。课题组近期研究显示，藿朴夏苓汤具有改善血脂代谢异常、抗炎等药理作用［6－9］，发挥显著降脂、保肝、抗MAFLD作用［10］，但目前关于其降脂、抗MAFLD的药理机制以及物质基础尚不明确。本研究旨在细胞水平上观察藿朴夏苓汤主要成分对PPARα信号的影响，探讨藿朴夏苓汤降脂、抗MAFLD的作用机制及其物质基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 药品与试剂 油酸（OA，批号：O108485）、棕榈酸（PA，批号：P101061）、非诺贝特（批号：F129682），阿拉丁化学生物试剂公司；广藿香醇（批号：P0279）、厚朴酚（批号：P0223）、琥珀酸（批号：P0928）、甘油三油酸酯（批号：P0915）、茯苓酸（批号：P0734）、苦杏仁苷（批号：hzm4145）、乙酰泽泻醇A（批号：YRA1687）等对照品，上海纯优生物科技有限公司；HepG2和HEK293T细胞株均购于上海纪宁细胞库中心；FuGENE6转染试剂（批号：E2691）、pCDNA3.1（批号：E1751）、pCDNA3.1－hPPARα（批号：FXC03156）、pCDNA3.1－CPT1α－luc（批号：C395A）和pGL3－CMV Renilla（批号：E2231），美国Promega公司；PPARαsiRNA（批号：sc－36308）和Control siRNA质粒（批号：sc－37007），美国Santa Cruz Biotechnology公司；甘油三酯（TG）测定试剂盒（批号：A110－1－1），中国南京建成生物工程研究所；总RNA提取试剂盒（批号：200506），中国宝成生物工程（大连）有限公司；逆转录试剂盒（批号：20200612），大连宝成TAKARA公司。TaqMan Gene Expression Master Mix的real－time PCR反应液（批号：20200411）、实验使用的TaqMan探针包括PPARα探针（批号：Hs00947538_m1）、CPT1－α探针（批号：Hs00912671_m1）、ACO探针（Hs01074241_m1）、FAS探针（Hs00188012_m1）、CD36探针（Hs01074241_m1）、FABP1探针（Hs00155026_m1）、FATP2探针（Hs 01587915_m1）和GAPDH探针（批号：Hs02786624_g1），美国ABI公司；PPARα抗体（批号：ab215270），英国Abcam公司。

1.1.2 仪器与设备 StepOne Plus Real－time实时荧光定量PCR仪，美国ABI公司。BDU－700核酸蛋白分析仪，美国Beckman公司。KDC－120HR高速冷冻离心机，中国安徽中科中佳科技仪器有限公司。BT3000全自动生化分析仪，意大利爱康公司。Enspire plus多功能酶标仪，美国PerkinElmer公司。BX53奥林巴斯荧光显微镜，日本奥林巴斯公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养与处理 HepG2细胞培养于37℃含5.0%CO2的孵箱，细胞培养基为含10%FBS、100μg/mL链霉素和100 U/mL青霉素的DMEM培养基。HepG2按1×106种于6孔板中，细胞贴壁后，分为对照组（DMSO）、模型组、厚朴酚低、中、高剂量组（2.5，10，40μmol/L）和非诺贝特组（10 μmol/L）。模型组采用OA+PA（2∶1，1 mmol/L）诱导24 h模拟细胞内脂质积蓄模型，对照组给予相应的生理盐水。各组细胞分别预先给予相应药物作用24 h后，随后加入OA+PA诱导24 h。

1.2.2 CPT1α－luc荧光素酶报告基因活性分析在反式激活实验中，HEK293T细胞按1×104种于96孔板中，贴壁后，细胞采用FuGENE6转染试剂瞬时转染pCDNA3.1、pCDNA3.1－hPPARα（100 ng/孔）、pCDNA3.1－CPT1α－luc（200 ng/孔）和pGL3－CMV Renilla荧光素酶质粒（10 ng/孔，对照质粒）12 h，然后分别加入DMSO（对照组）、非诺贝特（终浓度10μmol/L）、广藿香醇（终浓度10μmol/L）、厚朴酚（终浓度10μmol/L）、琥珀酸（终浓度10μmol/L）、甘油三油酸酯（终浓度10μmol/L）、茯苓酸（终浓度10μmol/L）、苦杏仁苷（终浓度10μmol/L）和乙酰泽泻醇A（终浓度10μmol/L）作用24 h后，采用Enspire plus多功能酶标仪，按照Promega双荧光素酶报告检测系统的方法，测定各组荧光素酶报告基因活性。1.2.3 免疫荧光分析厚朴酚对PPARα核易位的影响 HepG2按1×104种于24孔板中，贴壁后，加入厚朴酚作用24 h后，随后加入OA+PA诱导24 h。采用PBS冲洗3次，细胞加入10%多聚甲醛固定20 min，PBS冲洗3次，加入0.5%Triton X－100/PBS溶液通透10 min，PBS冲洗3次，加入5%BSA封闭30 min后，加入PPARα1抗（1∶200），4℃摇床孵育过夜。PBS冲洗3次，加入FITC荧光2抗，37℃避光孵育30 min后，PBS冲洗3次，加入0.5μg/mL的DAPI孵育5 min，PBS冲洗3次后，镜检。

1.2.4 分子对接实验 靶标蛋白结构的获取和预处理：从蛋白质数据库下载PPARα的三维晶体结构（PDBID：3ET1；网址：https：//www.rcsb.org/search），并导入分子对接软件MOE（2008.10版本），去除不相关的配体和水分子，在pH7和温度300K下对蛋白质进行Protonate 3D加氢和加电荷处理以及能量最小化操作。

小分子配体构建和预处理：从PubChem数据库下载厚朴酚三维结构，通过MOE软件对所有分子进行加氢和能量最小化处理，保存。

分子对接：为了预测受体和配体的结合能力，选择AMBER10：EHT力场以及R－field隐式溶剂模型进行分子对接。对接过程采用induced fit模式和Triangle Matcher放置函数，其中结合口袋的侧链可以根据配体构象自动调整，约束侧链旋转的重量设置为10，最后通过Londond G和GBVI/WSAdG评分功能进行打分，打分越低，配体与受体结合越稳定，并通过氨基酸残基结合的数目评价化合物与靶点的结合活性。

1.2.5 厚朴酚对OA+PA诱导HepG2细胞脂质水平的影响 HepG2细胞采用PBS冲洗2次，4%多聚甲醛固定细胞20 min，60%异丙醇分化3 min，加入新鲜配制的油红O染色液（油红储存液－去离子水3∶2）染色20 min，洗去多余染料，苏木素染核30 s，蒸馏水冲洗数次后置于显微镜下观察并拍照。将各组细胞消化后，收集细胞，按照TG检测试剂盒说明书测定细胞内TG含量。

1.2.6 Real－time PCR测定细胞中脂质合成、吸收、氧化分解相关的基因mRNA表达水平 HepG2细胞采用PBS冲洗2次，采用Trizol试剂提取、纯化细胞总mRNA，并测定其浓度及纯度。采用大连宝成TAKARA公司的cDNA逆转录试剂盒进行逆转录，采用StepOne Plus Real－time实时荧光定量反应，测定细胞中PPARα、CPT1－α、ACO、FAS、CD36、FABP1和FATP2的mRNA相对表达量。Real－time PCR反应体系：cDNA模板5μL，Taq－Man探针1μL，ddH2O 4μL，TaqMan Fast Advanced Master Mix 10μL，总体积20μL。用StepOne Plus荧光定量分析仪进行扩增反应，反应条件：95℃2 min；95℃5 s、60℃30 s读板，40个循环。记录各组样品扩增反应的Ct值，以GAPDH作为内参基因，采用2－△△Ct法计算目的基因的相对表达量。

1.2.7 PPARα敲减实验研究 HepG2按1×106种于6孔板中，贴壁后，采用FuGENE6试剂瞬时转染PPARαsiRNA和Control siRNA质粒12 h后，加入厚朴酚作用24 h后，随后加入OA+PA诱导24 h。按“1.2.3项”和“1.2.6”项进行处理，分别测定细胞脂质蓄积、TG含量以及脂质合成、吸收、氧化分解相关的基因mRNA表达水平。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 藿朴夏苓汤代表性化学成分对PPARα信号的影响

为了找寻激动PPARα的成分，对藿朴夏苓汤中代表性化学成分进行了CPT1α－luc荧光素酶报告基因活性分析。如图1～4所示，与对照组比较，阳性对照药非诺贝特和厚朴酚显著提高CPT1α－luc荧光素酶报告基因活性，提示厚朴酚可激动PPARα信号。分子对接结果显示厚朴酚通过Cys276、Lys358、Thr279等氢键方式与PPARα的LBD进行分子－蛋白质相互作用。

图1 藿朴夏苓汤代表性化学成分CPT1α－luc荧光素酶报告基因活性分析

此外，与对照组比较，厚朴酚中、高剂量组可显著提高PPARα及其下游靶基因CPT1－α的mRNA表达水平（P〈0.05，P〈0.01），差异有统计学意义。免疫荧光分析显示厚朴酚呈现剂量依赖性提高HepG2细胞内PPARα的蛋白水平，并促进PPARα核易位作用。

以上结果提示厚朴酚可激动PPARα信号，可能是藿朴夏苓汤降脂、抗MAFLD作用的关键成分。

图2 厚朴酚与PPARα的LBD分子对接结果

图3 厚朴酚对PPARα和CPT1α的mRNA表达水平的影响

2.2 厚朴酚对OA+PA诱导HepG2细胞脂质水平的影响

油红染色实验显示，与对照组比较，模型组中HepG2细胞内红色脂滴聚集和TG水平明显增加，表明OA+PA诱导的细胞内脂质堆积增加。与模型组比较，厚朴酚中、高剂量组均可明显降低细胞内红色脂滴聚集和细胞内TG水平（P〈0.05，P〈0.01），差异有统计学意义。结果表明，厚朴酚可显著降低OA+PA诱导的HepG2细胞内脂质沉积作用。结果见图5和图6。

图4 免疫荧光分析厚朴酚对PPARα核易位的影响

图5 厚朴酚对OA+PA诱导细胞内红色脂滴聚集的影响

图6 厚朴酚对OA+PA诱导细胞内TG含量的影响

2.3 厚朴酚对OA+PA诱导HepG2细胞脂质合成、转运和氧化代谢相关基因的影响

与对照组比较，模型组细胞内主要脂质合成和转运基因（FAS、CD36、FABP1和FATP2）的mRNA表达水平著升高，而脂质氧化代谢基因（PPARα、CPT1－α和ACO）则显著降低（P〈0.01），差异有统计学意义。与模型组比较，厚朴酚中、高剂量组可显著抑制OA+PA诱导的脂质合成和转运基因FAS、CD36、FABP1和FATP2的基因表达，而提高脂质氧化代谢基因PPARα、CPT1－α和ACO的表达（P〈0.05，P〈0.01），差异有统计学意义。结果见图7和图8。结果表明，厚朴酚可以上调PPARα核受体表达水平，导致提高OA+PA诱导的细胞内脂质氧化代谢作用和降低脂质合成和转运作用。

图7 厚朴酚对OA+PA诱导HepG2细胞内脂质合成和转运基因的mRNA表达水平的影响

图8 厚朴酚对OA+PA诱导HepG2细胞内脂质氧化代谢基因的mRNA表达水平的影响

2.4 敲减PPARα后，厚朴酚对OA+PA诱导HepG2细胞内脂质水平积蓄作用的影响

为了验证PPARα信号在厚朴酚降脂、抗MAFLD作用中的重要性，我们进行了细胞水平的PPARα敲减作用。在Control siRNA（si－Control）组中，与模型组比较，厚朴酚高剂量组明显降低细胞内红色脂滴聚集和细胞内TG水平，差异有统计学意义（P〈0.05，P〈0.01）。相反，在PPARαsiRNA（si－PPARα）组中，当敲减HepG2细胞内PPARα，与模型组比较，高剂量组厚朴酚失去了降低细胞内红色脂滴聚集和细胞内TG水平的作用，差异无统计学意义（P〉0.05）。结果表明，厚朴酚降低OA+PA诱导的HepG2细胞内脂质沉积作用依赖于PPARα的表达。结果见图9和图10。

图9 敲减PPARα后，厚朴酚对OA+PA诱导细胞内红色脂滴聚集的影响

图10 敲减PPARα后，厚朴酚对OA+PA诱导细胞内TG含量的影响

2.5 敲减PPARα后，厚朴酚对OA+PA诱导HepG2细胞内脂质合成、转运和氧化代谢相关基因的影响

在si－Control组中，与模型组比较，厚朴酚高剂量组可明显抑制OA+PA诱导的脂质合成和转运基因FAS、CD36、FABP1和FATP2的基因表达，而提高脂质氧化代谢基因PPARα、CPT1－α和ACO的表达（P〈0.05，P〈0.01），差异有统计学意义。相反，在si－PPARα组中，当敲减HepG2细胞内PPARα的表达，与模型组比较，高剂量组厚朴酚失去了对上述脂质合成、转运和氧化代谢相关基因的调控作用，差异无统计学意义（P〉0.05）。结果见图11和图12。结果表明，厚朴酚降低OA+PA诱导的HepG2细胞内脂质合成、转运和氧化代谢相关基因的调控作用依赖于PPARα的激动作用。

图11 敲减PPARα后，厚朴酚对OA+PA诱导HepG2细胞内脂质合成和转运基因的mRNA表达水平的影响

图12 敲减PPARα后，厚朴酚对OA+PA诱导HepG2细胞内脂质氧化代谢基因的mRNA表达水平的影响

3 讨论

代谢相关脂肪性肝病（MAFLD）是一种常见肝脏脂肪代谢异常诱发的代谢类疾病，是一个亟待解决的全球性公共健康问题。其主要表现为甘油三酯（TG）以脂滴的形式在肝细胞中异常积累［11－12］，通常而言，肝脏脂肪变性可进一步发展为非酒精性脂肪肝炎、肝硬化，甚至肝癌［11－12］。

MAFLD发生发展的核心是肝脏脂质异常沉积，主要由于脂肪酸β氧化分解不足或脂质合成吸收过度导致［13－14］。该过程主要由于受损肝细胞核受体转录因子PPARα失去对下游参与肝细胞脂质的合成、摄取/转运和脂肪酸氧化等相关基因（合成基因ACC、FAS、SCD1等，摄取/转运基因CD36、FATP1等，脂肪酸氧化基因CPT1－α、LCAD、MCAD、ACO等）的调控作用［13－15］。临床研究显示，与健康志愿者比较，MAFLD患者肝脏组织的PPARα及其氧化代谢基因显著降低，而脂质合成和吸收基因则升高［16］。相似地，小鼠肝脏缺失PPA－Rα基因导致提高肝脏脂质沉积的敏感性［17］。相反，贝特类药物药理性活化PPARα则显著改善高脂饮食诱导的脂质堆积作用［18］，提示了PPARα激动剂在MAFLD治疗中的重要作用。然而，尽管非诺贝特作为临床一线常用PPARα激动剂显示出较好的改善MAFLD作用，但存在安全性、副作用等问题［19］，在一定程度上限制了广泛应用。因此，找寻、开发低毒、有效的PPARα激动剂在治疗MAFLD中意义重大。

藿朴夏苓汤“理气化湿、疏表和中”，切中MAFLD病机，临床和实验研究显示良好的保肝、降脂、抗炎、抗MAFLD作用［1-10］，但抗MAFLD药理作用机制和物质基础不明。为了阐释其抗MAFLD作用，我们首先通过对方中的代表性成分进行筛选，如广藿香醇（广藿香的主要成分）、厚朴酚（厚朴的主要成分）、琥珀酸（半夏的主要成分）、甘油三油酸酯（薏苡仁的主要成分）、茯苓酸（茯苓的主要成分）、苦杏仁苷（杏仁的主要成分）、乙酰泽泻醇A（泽泻的主要成分），并对这些成分进行反式激活实验研究，筛选PPARα激动剂。研究结果表明厚朴酚可提高CPT1α-luc荧光素酶报告基因活性，通过氢键形式加强厚朴酚与PPARα的LBD域进行互作，促进PPARα核易位，导致提高PPARα及其下游靶基因CPT1-α的表达，并抑制脂质合成和吸收基因的表达，显著改善OA+PA诱导HepG2细胞内脂质沉积。我们的研究结果与Tian Y等报道相一致［20］。

为了进一步阐述厚朴酚降低细胞内脂质沉积作用依赖于PPARα的激动效应，我们随后进行了HepG2细胞PPARα敲减实验。研究显示PPARα敲减后，厚朴酚对脂质氧化分解基因和脂质合成、吸收等基因无明显的调控作用，进而损害厚朴酚降低细胞内脂质的作用，证实厚朴酚降脂作用是依赖于与PPARα的参与。

CPT1-α和ACO均是脂质氧化分解过程中的关键限速酶，分别催化线粒体和过氧化物酶体β氧化［21］。研究表明，PPARα的激活能诱导线粒体和过氧化物酶体中与脂质氧化相关的一系列基因的转录，从而降低肝脏脂质水平［18］，通过肝细胞特异性的过氧化物酶体基因敲除或抑制ACO活性会导致肝脏脂质蓄积［22］。本研究显示，OA+PA诱导显著降低PPARα、CPT1-α和ACO的表达，这些结果表明，脂质的蓄积可能会导致肝细胞氧化能力受损，进而促进肝细胞脂质积累。经厚朴酚处理后，PPARα、CPT1和ACO的表达均升高，提示厚朴酚可通过PPARα途径增加肝细胞脂质氧化能力，在一定程度上减轻肝细胞脂肪积蓄。

另一方面，肝脏对循环脂肪酸的吸收/转运主要依赖于FAS、CD36、FABPs、FATPs，FAS是脂肪酸合成限速酶，其活性或基因表达的增加可以促进脂肪的合成。有研究表明，MAFLD患者肝脏中FAS、CD36、FABP1表达明显高于正常肝脏组织［23-24］。抑制FAS、CD36和FABP1的表达则显著降低肝脏脂质沉积，发挥改善MAFLD作用［25-27］。本研究显示，OA+PA诱导显著提高FAS、CD36，FABP1和FATP2的表达，表明通过提高细胞内脂质合成和吸收作用进而促进肝细胞脂质积累。然而，经厚朴酚处理后，FAS、CD36、FABP1和FATP2的表达均降低，提示厚朴酚可通过PPARα途径抑制肝细胞脂质合成、吸收作用，进而减轻肝细胞脂肪堆积。

综上所述，本研究在细胞水平上显示藿朴夏苓汤成分厚朴酚通过激动PPARα信号通路，降低脂质合成和吸收，并提高脂质氧化分解作用，进而改善OA+PA诱导的肝细胞脂肪积蓄。