惠阳胡须鸡禽白血病病毒多样性PCR-HRM技术检测方法的建立与应用

陈 圆，陈岸妃，李红伟，张春红，郭鹏举

（1.惠州学院 生命科学学院，广东 惠州 516007；2.广东省农业科学院动物卫生研究所，广东广州 510640；3.广东省实验动物监测所 广东省实验动物重点实验室，广东 广州 510000）

惠阳胡须鸡，广东省三大名鸡之一，是我国优良的地方鸡种［1-2］．近年来随着禽白血病病毒的入侵，当地禽养殖业受到的危害日趋严重．禽白血病是由禽白血病病毒感染鸡禽体内而引发的的各种可传染的良性或者恶性肿瘤疾病的统称［3］，该病毒可通过感染鸡禽类的血浆、泄殖腔、蛋清、精液等进行传播［4］．根据禽白血病病毒（ALV）的囊膜蛋白的抗原性、交叉免疫反应等多种特性，将禽白血病病毒分为A、B、C、D、E、K、J共7个亚群［5-9］．目前，检测禽白血病常用的方法为ALV p27抗原的ELISA方法，虽然ELISA检测灵敏快速，但无法区分内源性禽白血病病毒［10-11］；gp85基因体外扩增（PCR）诊断技术，通过ALV囊膜gp85基因两端的一段序列分别设计引物进行检测，虽然灵敏度较高，但假阳性也高．显然，这些方法均有一定的缺陷，无法对禽白血病病毒进行快速、准确的分析［12-14］．

PCR—高分辨熔解曲线分析技术（PCR-high resolution melting curve analysis，PCR-HRM）是将RT-PCR与HRM分析技术两者联合起来．RT-PCR技术在分析基因的转录水平、获取目的基因、合成cDNA探针等方面有着广泛的运用，使RNA检测的灵敏性大大提高，使一些极为微量RNA样品分析成为可能，该方法成为早期诊断禽白血病较稳定、快速、灵敏的方法［15-17］．HRM是近年来兴起的单核苷酸多态性（SNP）和基因分型快速检测新方法，通过实时监控升温过程中双链DNA荧光染……