天然橡胶胶乳避孕套微生物检查法适用性研究

卜红宇 高瑞霞 吕玲英 韩峰 内蒙古自治区药品检验研究院 （内蒙古 呼和浩特 010020）

内容提要： 对16个厂家天然橡胶胶乳避孕套进行微生物检查法适用性研究，确立了各厂家产品微生物检查法。结果表明，不同厂家产品对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性不同；I厂家需氧菌总数需采用1:50平皿法，其余厂家产品需氧菌总数和霉菌及酵母菌计数可采用1:10平皿法；大肠埃希菌、铜绿假单胞菌及白色念珠菌均可采用常规法检测；金黄色葡萄球菌可分别采用常规法、稀释法及“中和剂+稀释法”进行检查。

天然胶乳橡胶避孕套在我国计生工作和疾病防控工作中发挥着重要作用，其质量和卫生性能备受关注。我国是天然胶乳橡胶避孕套的生产和消费大国[1]，目前执行标准《GB7544-2019天然橡胶胶乳男用避孕套技术要求与试验方法》，其规定了避孕套的最低技术要求和试验方法。避孕套为非无菌医疗器械产品，关于微生物污染控制方面，标准建议不得检出金黄色葡萄球、铜绿假单胞菌和肠杆菌科细菌；同时给出了微生物检查的操作要点，但并未给出具体实验参数[2]；此外不同生产厂家采用原辅料、工艺配方不同，产品的抑菌活性则不同，检查法亦不同。因此本研究参照《中国药典》[3]2020版的规定，对16个厂家的产品进行微生物检查法适用性研究，制定各产品微生物检查法。此外由于白色念珠菌是外阴阴道念珠菌病的主要感染菌种[4]，所以在本研究中同时建立了白色念珠菌的检查法。

1.实验部分

1.1 材料与仪器

培养基：蛋白胨水、胰酪大豆胨琼脂、沙氏葡萄糖液体、沙氏葡萄糖琼脂、甘露醇氯化钠琼脂、胰酪大豆胨液体、麦康凯琼脂、麦康凯液体、十六烷三甲基溴化铵琼脂、念珠菌显色琼脂（美国BD公司），吐温-80、卵磷脂（东京化成工业）。

菌种：铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC(B)10104]、 枯 草 芽 孢 杆 菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B)63501]、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B)26003]、 大 肠 埃 希 菌（Escherichia coli）[CMCC(B)44102]、 白 色 念 珠 菌（Candida albicans）[CMCC(F)98001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F)98003]（中国食品药品检定研究院）。

样品：天然橡胶胶乳避孕套，生产厂家A（批号：70802），B（批号：20190306），C（批号：180602），D（批号：16114、18120106 003），E（批号：18122108），F（批号：17041101），G（批号：LH180912），H（批号：18086JD），I（批号：19010702），J（批号：18010611），L（批号：1811/10），M（批号：23807AC、23851AB），N（批号：U8I810S），O（批号：1000745338、1000659343），P（批号：SD18091），Q（批号：1808021、1811011），S（批号：23851AB）。

仪器：AC2-4SI型生物安全柜（Esco集团），PL602-S型电子天平（梅特勒托利多集团），MIR-554型培养箱（日本三洋公司），高压蒸汽灭菌柜（德国洁定有限公司），超低温保存箱（海尔集团），Easy MIX型均质器（生物梅里埃法国公司），移液器（德国艾本德科学公司）。

1.2 菌液制备

取铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌及白色念珠菌的新鲜培养物，制成5000～10000 CFU/mL的菌悬液。取培养5～7d的黑曲霉培养物，将孢子洗脱，制成5000～10000 CFU/mL的孢子悬液。

1.3 供试液制备[5]

取供试品10g，用无菌棒与镊子展开，置于均质袋中，加入含吐温-80、卵磷脂（用量需经验证）的蛋白胨水至100mL，用均质器拍打（时间需经验证），作为1:10的供试液；另取该供试液20mL，加80mL蛋白胨水，制成1:50供试液。

1.4 需氧菌总数、霉菌及酵母菌计数方法适用性试验

需氧菌总数：平皿法，取1:10供试液9.9mL和0.1mL试验菌混匀；稀释法，取1:50供试液9.9mL和0.1mL试验菌混匀；取供试液1mL，注入直径9cm培养皿。

霉菌及酵母菌计数：平皿法，取1:10供试液5mL，注入直径15cm培养皿。

1.5 控制菌检查方法适用性试验

取4份10mL 1:10供试液，分别加入小于100 CFU的大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌，再加入一定体积（需验证）含吐温-80、卵磷脂（用量需验证）的增菌培养液；依各控制菌检查法，在规定的温度和最短的时间下培养，应能检出所加试验菌的反应特征。

2.微生物检查法适用性试验结果

从表1中可以看出，除I厂家外，其余各厂家供试品对人工污染的铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌及黑曲霉的回收率均在50%～200%，说明可采用1:10平皿法检测需氧菌、霉菌和酵母菌；而I厂家供试品抑制枯草芽孢杆菌，采用1:50平皿法检测，枯草芽孢杆菌回收率为76.9%，说明需采用1:50平皿法检测检测需氧菌总数。

表2可看出，大肠埃希菌、铜绿假单胞菌及白色念珠菌均可采用常规法检测；而各厂家供试品对金黄色葡萄球菌的抑菌活性较强，并且不同厂家供试品抑菌活性不同，这提示金黄色葡萄球菌为供试品敏感菌；其中G、H、L、M、O及P厂家的供试品可采用常规法检查，A、C及E厂家供试品可采用稀释法，而厂家B、D、F、I、J、N及Q供试品需采用“中和剂+稀释法”进行检测。

表1. 需氧菌总数、霉菌及酵母菌计数适用性试验回收率(%)

表2. 控制菌验证试验结果

另外，本试验中随机抽取了4个厂家，每个厂家抽取2批供试品，旨在对比同厂家不同批号供试品的微生物检查法。结果表明同厂家不同批号的供试品（“D-1、D-2”“M-1、M-2”“O-1、O-2”及“Q-1、Q-2”）需氧菌、霉菌及酵母菌（表1）和控制菌（表2）的检查方法均一致。

3.小结

研究结果表明不同厂家产品对试验菌的抑菌活性不同，而同厂家不同批号供试品微生物检查法均一致；另外确立了16个厂家供试品的微生物检查法；该研究为监管部门及生产厂家控制监测微生物污染提供了方法依据。此外，建议将白色念珠菌检查项目纳入国家标准。