容积激活性氯离子通道蛋白ClC-3表达下调促进H9c2心肌细胞肥大及其机制研究

孙 宇，陈梦青，汪 帅，李艳文，喻 阳，李咏琪，李春梅

心肌肥大的主要特点是心肌细胞体积增大，易引发心律失常，最终导致心力衰竭和心肌梗死等疾病。ClC-3是电压门控氯通道基因家族成员之一，在心脏、脑等组织中广泛表达。许多研究表明，ClC-3的功能具有多效性，包括作为容积调节性氯离子通道的关键组成部分，能调节细胞体积，保护心肌细胞免受低氧、缺血或肥大时细胞体积过度增加的影响。前期研究表明异丙肾上腺素能诱导大鼠原代心肌细胞、H9c2细胞和C57小鼠ClC-3表达降低，且AAV-9介导的ClC-3过表达小鼠能明显抑制异丙肾上腺素诱导的心肌肥厚。该研究利用siRNA转染H9c2心肌细胞构建ClC-3表达下调模型，观察其对心肌细胞的影响及机制，为研究ClC-3在心脏中的功能提供借鉴，同时也为临床心肌肥大的防治提供思路。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要试剂

H9c2细胞购自上海中国科学院细胞库。异丙肾上腺素(ISO)购自美国Sigma公司。ClC-3一抗购自英国Abcam公司。siRNA ClC-3及转染试剂盒购自苏州瑞博生物有限公司。Bradford蛋白浓度试剂盒、JC-1线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential，MMP)试剂盒、细胞骨架染色α-Tubulin一抗均购自北京碧云天生物技术有限公司。DMEM培养基、FBS胎牛血清、0.25%胰酶均购自上海Gibco公司。TRIzol购自大连TaKaRa生物公司。PCR引物由上海生工生物工程有限公司设计并合成。Prime ScriptTMRT Reagent及SYBR PCR Mix购自日本ToYoBo公司。

1.2 主要方法

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细胞培养及分组 大鼠H9c2心肌细胞株在含10%的胎牛血清的DMEM培养基中培养，每2 d更换1次。在37 ℃、5% CO的培养箱中培养传代，取对数期、生长良好的细胞进行实验。将2×10个细胞接种于6孔板中，待细胞融合度达到60%～70%时进行转染。……