高浓酿造啤酒发酵周期的研究进展

张亚萌，王金晶 *，钮成拓，郑飞云，刘春凤，李 崎

（1.江南大学 生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122；2.江南大学 生物工程学院 酿酒科学与工程研究室，江苏 无锡 214122）

啤酒是水和茶之后世界上消耗量排名第三的饮料，由于其口感清爽、营养物质丰富，深受消费者青睐。啤酒的发展历史悠久，并且经济的高速崛起促进了啤酒酿造新技术的开发，其中高浓酿造技术发展最为迅速，如今已成为一项成熟技术。啤酒生产中，正常麦汁浓度为10～12°P，而高浓酿造是指使用较高浓度麦汁发酵，之后用脱氧水稀释至所需浓度，一般高浓麦汁浓度为16～18°P，大于18°P则称为超高浓麦汁[1]。20世纪70年代，由美国和加拿大率先推出高浓酿造啤酒，大大提高了生产效率及设备利用率，这种生产工艺在啤酒行业得到了广泛应用。目前高浓酿造存在的问题之一是发酵周期长，高浓麦汁造成高渗透压环境、高水平乙醇生产，从而对酵母发酵性能产生不利影响，降低发酵度及发酵速度。本文综述了高浓酿造发酵周期的影响因素，旨在为啤酒行业解决这一问题提供理论参考。

1 高浓酿造工艺特点

高浓酿造一大工艺要点是制备高浓麦汁，一般采用两种方法。一是在原本工艺基础上加大投料量，但这种方式会导致糖化醪黏度升高，过滤困难，降低原料利用率，同时还会导致酒花利用率低，煮沸时间延长，增加能耗[2]。另一种方法是适当使用糖浆，在煮沸麦汁结束前加入糖浆，调整到所需的浸出物浓度，避免了上述问题且不影响麦汁质量，同时能够降低能耗、减少麦芽用量[3]，故此方法应用更广泛。

稀释工艺是高浓酿造的另一要点，可以在任一生产环节进行，如麦汁冷却后、发酵过程中、啤酒后熟期等。稀释用水的要求很严格，应当无异味，具有和被稀释啤酒相同或十分接近的温度、pH[2]。

结合工艺来看，高浓酿造具有提高设备利用率及产量、降低能耗和成本、增加产品灵活性等诸多优点[2，4]；不可避免也存在以下问题[2，4]：①由于麦汁浓度高，糖化时原料浸出率及酒花利用率下降；②泡持性相对较差；③对啤酒酵母产生不利影响，降低酵母活力及发酵性能，致使发酵迟缓、发酵周期长；④高浓酿造啤酒稀释后酒体偏淡，风味物质不平衡。

2 高浓酿造对发酵周期的影响

2.1 原料质量

啤酒发酵主要是依靠啤酒酵母吸收并利用麦汁中的营养物质（主要指碳源和氮源）进行繁殖，在其代谢过程中产酒精及一系列醇酯等风味物质。因此麦汁质量往往直接影响酵母的生长进而影响发酵过程。

麦汁浸出物中90%是糖类，其中可发酵性糖主要包括麦芽糖、麦芽三糖、葡萄糖，各组分比例的改变会影响酵母的代谢，如葡萄糖阻遏效应。高浓麦汁制备时一般要添加糖浆，各糖类比例也就随原料的不同而发生变化。研究发现，高浓酿造时，与添加葡萄糖相比，添加麦芽糖可以使酵母的发酵性能更均衡，麦汁中细胞数更多，发酵力更高，同时还有利于啤酒的风味特征[5]。但是麦芽糖比例并不是越高越好，RAUTIO J J等[6]研究发现在高麦芽糖的高浓麦汁中，葡萄糖阻遏效应并不明显，但后期酵母的麦芽糖代谢相关基因表达量会明显下滑。此外，麦汁浓度及添加的可发酵糖甚至添加时间都会影响酵母的发酵性能[7]。麦汁中碳源对酵母的影响机制是比较复杂的，葡萄糖和麦芽糖比例过高过低都会影响酵母的发酵，而且可能由于菌株差异、麦汁浓度等具体的影响均有不同。

麦汁中游离氨基氮（free amino nitrogen，FAN）是影响酵母生长和发酵的另一重要因素，也是评价麦汁质量的指标之一。最近有研究发现，10种氨基酸的同化量都与酵母发酵性能呈正相关，添加氨基酸可以提高HSP12的表达和海藻糖含量，增强酵母抗逆性[8]。有研究利用大孔树脂分离小麦面筋水解物，发现分离的组分能显著提高酵母细胞在不同环境胁迫下的发芽率并保持其形态，增强了酵母的乙醇耐受性、渗透胁迫耐受性[9]。FAN的充足保证了酵母的高效生长以及发酵的顺利进行，高浓酿造时则需要更多的游离氨基氮缓解酵母的环境压力。在高浓酿造中，添加氨基酸明显促进了酵母生长，提高了活酵母数以及发酵度[10-11]，并且对风味会产生一些影响，如添加组氨酸、亮氨酸、缬氨酸可以提高啤酒醇酯比[11]。还可以添加氨基氮补充剂（如酵母膏、氨基酸）或利用蛋白水解酶提高麦汁氨基氮含量，以改善酵母的发酵性能、增强抗逆性[4]。

综合以上两点，在高浓酿造中，酵母的生长需求更加严苛，麦汁质量的控制对发酵过程非常重要。应当选择合适的原料并适当调整麦汁组分以维持酵母的正常繁殖、提高酵母发酵性能，以避免发酵缓慢、发酵残糖过高等问题。

2.2 高浓酿造条件

酿造条件如发酵温度、接种量、麦汁浓度等会影响酵母的生命活动及各种生化反应，与啤酒质量息息相关。实际生产中，酿造工艺优化是必要的工作，尤其是高浓酿造，鉴于其酿造方式的特殊性，探究各发酵条件对啤酒发酵周期的影响至关重要。

2.1.1 主发酵温度对发酵周期的影响

主发酵温度是影响发酵的一个重要因素，提高主发酵温度，能加快酵母的生长代谢，从而缩短发酵周期。DRAGONE G等[12]研究了酒糟固定化酵母在3种不同温度（7 ℃、10 ℃和15 ℃）条件下连续高浓酿造中对发酵的影响。研究发现，随着发酵温度升高，发酵度、降糖速率、乙醇生产速率和游离氨基氮消耗量均随之增加。发酵温度对风味物质的产生也有较明显的影响，主发酵温度越高，高级醇及乙酸酯的产量也越高[13]，影响整体风味。WEBERSINKE F等[14]研究发现20 ℃发酵时，啤酒的风味、口感、整体性最好，适当地提高发酵温度可以改善啤酒品质。

2.1.2 麦汁浓度对发酵周期的影响

麦汁浓度越高，对酵母生理活性影响越大，有研究发现，随着麦汁浓度升高，酵母生长缓慢，活细胞率及降糖速率变低[15]，在发酵后期，又有一定乙醇积累，对酵母耗糖影响更大，从而使发酵周期延长。万春艳等[16]选用常浓酵母菌株分别于12°P、16°P、24°P麦汁中发酵，主发酵周期分别为7 d、15 d、28 d，麦汁浓度对主发酵周期的影响十分显著。

2.1.3 接种量对发酵周期的影响

在酒类酿造中，经常通过提高酵母接种量来加快发酵，该方法也适用于高浓啤酒生产。提高酵母接种量能够增加发酵液酵母细胞密度，提高糖利用率，缩短发酵周期[17-18]。然而，提高接种量也会影响风味物质的产生，VERBELEN P J等[19]研究发现，加大接种量会显著提高双乙酰含量，不利于啤酒的风味。接种量对一些挥发性醇酯的产生也有影响，有研究发现加大接种量会导致异丁醇产量增加，活性戊醇和异戊醇产量降低[17]。目前关于接种量对啤酒风味影响的研究结果之间存在矛盾，但可以肯定的是提高接种量往往会对风味产生负面作用，虽然该方法可以弥补高浓酿造发酵周期长的缺点，但需要兼顾风味质量并结合实际生产选择合适的接种量。

2.1.4 溶氧量对发酵周期的影响

在啤酒发酵中，麦汁充氧是很关键的工作，酵母接种后必须在一定氧浓度下才可以顺利繁殖，若供养不足则会导致发酵迟缓，同时会增加染菌风险[20]。氧能够促进不饱和脂肪酸和甾醇的合成，甾醇是酵母细胞膜的主要成分，影响多个生物学反应，这两种物质可以缓解高浓酿造带来的压力[21]，而且由于麦汁浓度较高，溶氧水平受到限制，所以需要增加供氧量以保证高浓发酵正常进行。JONES H L等[22]研究了高浓酿造的供养策略，发现适当增加供氧有利于酵母生长繁殖，此外与接种后立即供氧相比，在接种12 h后供氧，发酵时间大大缩减。然而，溶氧量过高会对加速啤酒老化，对风味及非生物稳定性产生不利影响[23]，在进入正常发酵后应严格控制溶氧量。

在啤酒酿造中，发酵条件对啤酒酿造的影响不是独立的，发酵进程与风味物质的产生紧密相关，每个条件的改变都会或多或少导致风味的变化，甚至原料、酵母菌株不同时，改变发酵条件所造成的影响也会有很大差异。实际生产中，要综合考量各方面需求，调整高浓酿造工艺。

3 菌株质量对高浓酿造发酵周期的影响

3.1 高浓酿造对酵母菌株的影响

高浓酿造在发酵前期渗透压较高，随着发酵进行，乙醇累积到一定水平会产生毒害作用。在这种高渗高乙醇毒性环境下，一方面酵母的生理性质会发生改变，包括细胞形态、细胞膜、发酵性能等；另一方面，酵母面对这种环境压力会产生生理响应，如海藻糖、甘油等[24]维持细胞生理稳定的物质含量增加。高浓酿造对酵母产生的影响反过来也影响着啤酒的生产过程，具体内容如表1所示。

表1 高浓酿造对酵母的影响Table 1 Effect of high gravity brewing on yeast

高浓酿造带来的环境胁迫会直接影响啤酒酵母多方面的生理性质，导致酵母活力明显降低，造成发酵缓慢、发酵度低等问题。LI X E等[29]通过紫外线诱变选育出了细胞壁加厚的啤酒酵母，提高了胞内海藻糖水平和细胞活性，在高浓酿造中酵母能够保持较快的发酵速度。由此可见，选育出抗逆性强的酵母可以作为解决高浓酿造发酵周期长这一问题的途径。

3.2 酵母性能对高浓酿造发酵周期的影响

3.2.1 酵母絮凝性

酵母絮凝作用是指发酵液中成千上万个酵母细胞聚集形成絮体并快速沉降的现象[30]，絮凝是啤酒酵母的重要特性。酵母的絮凝性会直接影响啤酒质量[31]：①絮凝性太强，酵母会过早沉降，导致发酵迟缓、双乙酰还原慢、发酵周期延长，还会造成发酵不彻底、残糖较高，影响啤酒风味；②絮凝性太差，酵母则悬浮于发酵液中，沉降时间长，不利于酒液澄清过滤，导致酵母难以回收，影响下次发酵。

影响酵母絮凝的因素包括遗传因素、环境因素。酵母絮凝性由多个FLO基因共同调控，不同FLO基因的组合形成了一系列絮凝特性，不同菌株的絮凝表现存在着较大差异[32]，酵母絮凝性的遗传调控相当复杂。在啤酒发酵过程中，酵母的絮凝能力也受生理环境的影响，如含氧量、温度、pH、乙醇浓度、可发酵糖、无机离子[32]。在实际生产中，可以通过育种技术选育絮凝性适中的酵母，结合生产需求适当调整工艺，如调整麦汁组成、改善酿造用水质量等[30]。

3.2.2 酵母的α-葡萄糖苷酶及糖通透酶表达能力

麦汁中主要的三种可发酵糖依次是麦芽糖、麦芽三糖和葡萄糖。葡萄糖通过促进扩散进入酵母细胞参与代谢，麦芽糖和麦芽三糖需借助糖通透酶进入细胞，再经α-葡萄糖苷酶水解，以葡萄糖的形式被利用[33]。葡萄糖会抑制α-葡萄糖苷酶和麦芽糖通透酶的合成，还会降解先前存在的麦芽糖通透酶[34]，因此酵母会在葡萄糖之后利用麦芽糖及麦芽三糖，这两种糖的发酵是主要限速步骤。啤酒生产中经常存在麦芽三糖消耗延迟甚至残留的现象，导致发酵不彻底、乙醇产量低。

已知的有关麦芽糖发酵的基因包括MAL、AGT1、MPH、MTT1、MTY1。MAL基因家族是5个端粒相关的MAL基因座，每个基因座至少包含三个基因：MALx1基因编码麦芽糖通透酶、MALx2编码α-葡萄糖苷酶和MALx3编码转录调控蛋白，在麦芽糖存在的情况下诱导前两个基因的转录[35]。麦芽糖转运基因以不同的组合方式存在于不同菌株中，在Lager酵母中主要是MALx1编码麦芽糖转运蛋白，Ale酵母中主要是AGT1编码麦芽糖转运蛋白，而MPH基因存在于Lager酵母中并且基因表达量较低[36]。HATANAKA H等[37]研究发现，Mal21p对葡萄糖的降解抗性较强，表达该蛋白的菌株有望同时利用葡萄糖和麦芽糖以加速发酵，但研究发现麦芽糖会抑制蛋白质合成，菌株无法生长。若酵母在摄取麦芽糖之前能够表达足够麦芽糖酶，就可以避免这种生长缺陷，这也为高浓酿造酵母选育提供了一个方向。

MAL编码的麦芽糖通透酶一般可以转运麦芽糖但不能转运麦芽三糖，而其他几种都被报道可以转运麦芽三糖[37-39]，但具体的转运能力存在诸多争议。Agt1p可以转运麦芽糖、麦芽三糖、异麦芽糖、海藻糖等多种α-葡萄糖苷[37]，并且是麦芽三糖转运中最主要、研究最多的转运蛋白。ALVES S L等[40]认为Agt1p可以帮助酿酒酵母高效发酵麦芽三糖，而且麦芽三糖可能是Agt1p更好的诱导剂。不断有研究发现新型的AGT1基因，如SbAGT1、Seub AGT1[41-42]，可以编码麦芽三糖转运蛋白，这些新基因可以用于菌种的选育工作。

酵母的麦芽糖、麦芽三糖转运机理非常复杂，仍有很大的研究空间，在高浓酿造育种中，这方面相关工作存在较大空白，以α-葡萄糖苷酶及糖通透酶为切入点进行菌种培育可以作为一个新思路。

3.2.3 酵母的双乙酰合成及还原能力

双乙酰是发酵过程的副产物，也是啤酒成熟的重要标志，其风味阈值是0.1 mg/L，含量过高会产生馊饭味，严重影响啤酒风味。双乙酰的产生有四条途径[43]：①酵母合成α-乙酰乳酸释放到胞外，经过氧化脱羧反应产生；②糖代谢时乙酰辅酶A与活性乙醛反应产生；③污染杂菌有可能产生双乙酰；④发酵后期酵母自溶释放α-乙酰乳酸反应生成。啤酒后发酵期主要任务之一是还原双乙酰，一般来说这个过程比较漫长，因此酵母合成和还原双乙酰的能力会显著影响发酵周期。

控制双乙酰含量的方法主要有三方面，减少α-乙酰乳酸形成；加快α-乙酰乳酸的消耗；加速双乙酰还原[43]。在工业生产中，可以利用诱变育种、原生质体融合育种、基因工程等手段获得低产双乙酰菌株。有研究构建了ILV2等位基因（α-乙酰乳酸合成反应相关基因）缺失、过表达BDH2基因（编码双乙酰还原酶）及ILV5基因（编码乙酰羟酸还原异构酶）菌株进行啤酒发酵实验，显著降低了双乙酰含量[44]。提高酵母的双乙酰还原力也是生产中常用的方法，不同酵母的双乙酰还原力有很大差异。BAMFORTH C W等[45]研究发现，乙醇脱氢酶在双乙酰的还原中有重要作用，除了乙醇脱氢酶，Ale酵母中还发现了一种双乙酰还原酶，Lager酵母中发现了两种，双乙酰还原酶体系更复杂。可以通过定向驯化的方法筛选双乙酰还原能力强的酵母，有研究已成功利用高浓度双乙酰或苯磺隆、甲磺隆驯化出双乙酰降解快的酵母[46]。除了选育优良酵母菌株，还可以利用α-乙酰乳酸脱羧酶（acetolactate decarboxylase，ALDC）减少双乙酰的生成，ALDC可直接将α-乙酰乳酸转化为乙酰丙酮，在啤酒酿造中利用ALDC可以在不破坏啤酒风味的前提下，缩短后酵时间[47]。

酵母是啤酒的灵魂，优良菌株是优质啤酒生产的前提条件，以上所述只是酵母与发酵周期相关的主要三个性能。OOMURO M等[48]的研究还发现S-腺苷蛋氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）在低温高浓酿造中起积极作用，在高浓麦汁中，产SAM酵母突变株发酵速率很快。有关高浓酿造酵母的相关研究还需要继续深入探索，为选育专用酵母提供筛选方向。

4 展望

在高浓酿造啤酒的生产中，发酵缓慢、发酵度低是常见的问题，发酵周期关系着企业的生产效率及经济效益，因此探究影响高浓酿造发酵周期的因素对实际生产至关重要。综上所述，高浓酿造技术的特殊性是导致发酵周期长的根本原因，一方面高浓麦汁发酵导致一些工艺条件对发酵周期的影响更显著；另一方面高浓酿造前期的高渗环境及后期的乙醇毒性对酵母发酵性能造成负面影响，进而使发酵周期延长。因此，为解决发酵周期长这一问题，需要从酿造工艺、酵母选育两个角度出发。可以通过改善麦汁质量、添加外源物等方法适当调整工艺，酵母选育工作以加速麦芽糖及麦芽三糖发酵为主要思路展开，同时要顾及风味物质生产、啤酒稳定性等方面的需求，以保证啤酒品质。