高效液相色谱法测定乌发护理液中二苯乙烯苷与特女贞苷的含量

何怡静，李孝栋

（福建中医药大学药学院，福建 福州350122）

乌发护理液由何首乌、女贞子等组成，可用于须发早白等症［1］。其中君药何首乌所含的二苯乙烯苷，可诱导酪氨酸酶（TYR）重要转录因子的激活，而TYR是黑素形成过程中的主要限速酶，其表达和活性决定着黑素合成的速度和产量［2-8］。因此，二苯乙烯苷是发挥乌发补益作用的主要药效成分。特女贞苷是女贞子中的特征成分，有研究显示女贞子提取物对体外培养毛囊的黑素细胞有促进作用［9-10］。黄丹等［11］建立了乌发生发液中二苯乙烯苷的含量测定方法，然而方中所含成分复杂，质量控制指标却很单一。本研究参考既往文献［9，12-13］，增加质量控制指标，优化含量测定方法，采用高效液相色谱法同时测定二苯乙烯苷和特女贞苷含量，以控制乌发护理液的质量。

1 仪器与试药

1.1 仪器AR2140电子天平（梅特勒-托利多仪器）；DHG-9240型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；HH-6数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）；LC-20AT型高效液相色谱仪（岛津公司）。

1.2 试药 二苯乙烯苷（大连美仑生物技术有限公司）；特女贞苷（成都普思生物科技股份有限公司）；乙腈（国药集团化学试剂有限公司）；药材饮片何首乌、女贞子等均购自福州闽侯上街致诚药店，由福建中医药大学中药鉴定教研室黄泽豪副教授鉴定。

2 方法与结果

2.1 溶液配制

2.1.1 对照品溶液 精密称定二苯乙烯苷、特女贞苷对照品适量，置于25 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，制成每1 mL含二苯乙烯苷500 μg、特女贞苷1 000 μg的对照品储备液，低温避光保存备用。精密吸取4 mL对照品储备液至10 mL棕色量瓶中，甲醇定容至刻度，作为对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液 取处方量的何首乌、女贞子等药材，粉碎，加入稀乙醇30 mL，浸泡30 min，加热回流45 min，放冷，过滤，稀乙醇定容至50 mL，微孔滤膜（0.45 μm）滤过，即得。

2.1.3 缺何首乌阴性样品溶液 取除何首乌之外的处方量药材，粉碎，精密加入稀乙醇25 mL，浸泡30 min，加热回流45 min，放冷，补足重量，微孔滤膜（0.45 μm）滤过，即得。

2.1.4 缺女贞子阴性样品溶液 取除女贞子之外的处方量的药材，粉碎，参照“2.1.3”项下缺何首乌阴性样品溶液的制备同法操作。

2.2 色谱条件Diamonsil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（17∶83）；检测波长：224 nm；进样量：10 μL；柱温：30℃；流速：1.0 mL／min。

2.3 专属性考察 在上述色谱条件下，分别取对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液进样，记录色谱图。结果如图1所示，供试品和对照品溶液的色谱图在相同的保留时间有一相同的色谱峰，而阴性样品无干扰。

图1 专属性考察色谱图

2.4 线性关系考察 精密吸取“2.1.1”项下对照品储备液0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、4.0 mL，分别置于10 mL棕色量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，分别按“2.2”项下色谱条件测定，记录峰面积，以峰面积（Y）对浓度（X，μg／mL）作图。二苯乙烯苷峰面积在5～200 μg／mL浓度范围内呈良好的线性关系，回归方程为Y＝17 539X－18 827（r＝0.999 8）。特女贞苷峰面积在10～400 μg／mL浓度范围内呈良好的线性关系，回归方程为Y＝11 563X－31 141（r＝0.999 9）。

2.5 精密度考察 取“2.1.1”项下对照品溶液，按“2.2”项下色谱条件连续进样6次，测定其二苯乙烯苷峰面积RSD为0.80%，特女贞苷峰面积RSD为1.28%，结果表明仪器精密度好。

2.6 稳定性考察 取同一份供试品溶液分别于0、2、4、8、12、24 h进样，按“2.2”项下色谱条件测定，二苯乙烯苷峰面积RSD为1.80%，特女贞苷峰面积RSD为1.06%，表明供试品溶液在24 h以内稳定。

2.7 重复性考察 取同一批样品6份，分别按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件测定，测得峰面积，并计算得二苯乙烯苷含量RSD为2.30%，特女贞苷含量RSD为3.59%，结果表明方法重复性好。

2.8 加样回收率考察 精密吸取已知含量的样品溶液6份，分别精密加入二苯乙烯苷、特女贞苷混合对照品溶液适量，置于10 mL量瓶中，加稀乙醇溶解定容至刻度，微孔滤膜滤过，分别按“2.2”项下色谱条件测定，计算回收率。结果如表1、表2所示，二苯乙烯苷的平均加样回收率为102.74%，RSD为0.94%，特女贞苷的平均加样回收率为104.82%，RSD为0.63%，表明本法准确性好。

表1 二苯乙烯苷加样回收率考察结果

表2 特女贞苷加样回收率考察结果

2.9 乌发护理液样品含量测定 取3批样品，按照“2.2”项下色谱条件，测定二苯乙烯苷及特女贞苷峰面积，代入标准曲线计算，结果见表3。

表3 乌发护理液样品含量测定mg／g

3 讨 论

特女贞苷在224 nm处有最大吸收，二苯乙烯苷在224 nm和320 nm处均与较强吸收，因此，选择224 nm作为检测波长［9］。

本方法采用C18色谱柱，流动相选为乙腈-水（17∶83），检测波长为224 nm，进样量为10 μL，柱温为30℃，流速为1.0 mL／min，可以快速测定乌发护理液中二苯乙烯苷和特女贞苷的含量，灵敏度高，专属性强，重复性好，可以控制乌发护理液质量标准，还可为含有何首乌和女贞子的制剂建立质量标准提供参考。