SOX5在口腔鳞癌CAL27细胞增殖、迁移和侵袭中的作用研究

王亚娥 孙李春 陈镭雨 曾妍 郑军

832000, 石河子大学医学院第一附属医院口腔科，石河子大学医学院新疆地方与民族高发病教育部重点实验室

性别决定区域Y盒蛋白5(SOX5)属SOXD亚族的成员，研究发现SOX5的异常表达参与多种肿瘤的发生、发展，包括垂体瘤、胶质母细胞瘤、淋巴瘤、肝癌等[1]，且与肿瘤的生物学行为密切相关，对于肿瘤而言，肿瘤细胞的生物学行为对于肿瘤的发展发挥着不可或缺的作用。本研究通过干扰SOX5探讨其对CAL27细胞增殖、迁移和侵袭的作用，为口腔鳞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)的诊治及预后提供参考。

1 材料与方法

1.1 细胞培养及转染

常规培养CAL27细胞，转染时提前一天将细胞接种至六孔板，按Lipofectamine 2000(Invitrogen,美国)说明书进行转染，对照组转染Si-NC,实验组转染Si-SOX5。转染后收集细胞，进行后续研究。

1.2 实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)

使用Trizol(Invitrogen,美国)提取细胞中总RNA。逆转录合成cDNA，QuantiNava SYBR Green RT-PCR Kit试剂盒(QIAGEN,德国)进行qRT-PCR。引物序列为：SOX5正向5' -AACAAGCACAGATCCCCATTG-3' 和反向5' -ACACCGTAAGTGCTCTGGATA-3'；GAPDH正向5' - GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3' 和反向5' - ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3' 。

1.3 免疫印迹实验(Western blot)

RIPA裂解缓冲液(北京索莱宝科技有限公司)提取细胞中总蛋白，电泳后将蛋白转移到PVDF膜上。按所需分子量裁膜，封闭后分别与SOX5(博士德生物工程有限公司)和GAPDH抗体稀释液4 ℃过夜孵育12 h左右，加入稀释后酶标羊抗兔IgG和酶标羊抗小鼠IgG(DAKO，美国)常温低速摇床孵育2 h。进行发光检测。

1.4 平板克隆实验

调整细胞密度加入6 孔板(5 000 个细胞/孔)，每组重复3 孔，继续培养10～14 d，定期换液，出现肉眼可见的克隆时停止培养，冰甲醇固定15 min，结晶紫染色30 min，冲洗晾干后拍照，细胞计数软件计数克隆细胞数，以数目大于50 个的细胞克隆为有效克隆，计算克隆形成率(%)=细胞平均克隆数/接种细胞个数(5 000)×100%。……