基于网络药理学的定眩汤治疗颈性眩晕的作用机制研究

武越 银河 陈琳 张威 周猷 魏戌 李晋玉 朱立国

摘要 目的：基于網络药理学探讨中药复方定眩汤治疗颈性眩晕的分子机制。方法：通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）数据库和BATMAN-TCM数据库筛选药物相关靶点，通过国际公认疾病基因数据库筛选疾病相关靶点，取交集后获得直接靶点并在STRING数据库中进行扩充，后进行网络拓扑分析获得定眩汤治疗颈性眩晕的关键靶点，进行基因本体（GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析，以进一步分析其治疗颈性眩晕的分子机制。结果：在TSMSP数据库与BATMAN-TCM数据库中共提取出活性成分所对应的靶点350个。在疾病基因数据库中得到与颈性眩晕相关的已知靶点253个。2组靶点映射后得到定眩汤作用于颈性眩晕的直接靶点21个，经STRING数据库扩充后得到199个直接和间接靶点。在Cytoscape中进行网络拓扑分析共筛选出99个关键节点，GO分析结果表明，关键节点的生物过程主要包括细胞增殖、细胞凋亡等;细胞成分主要包括核染色质、细胞外空间等;分子功能主要包括酶结合、DNA结合等。涉及的信号通路有MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、VEGF信号通路等。结论：定眩汤治疗颈性眩晕具有多成分、多靶点的特点;研究初步探讨了定眩汤作用的关键靶点及涉及的生物学过程和信号通路，发现其主要作用可能是影响骨平衡、调节骨代谢、促进血管的修复、调控相关炎症反应。

关键词 定眩汤;颈性眩晕;网络药理学;分子机制;信号通路;生物学过程;骨代谢;血管修复

Abstract Objective：To explore the possible molecular mechanism of Dingxuan Decoction in the treatment of cervical vertigo based on network pharmacology.Methods：Drug-related targets through the TCMSP database and BATMAN-TCM database were screened，disease-related targets through the internationally recognized disease gene database were screened，direct targets were obtained after the intersection and expanded them in the STRING database，and then network topology analysis was performed to obtain the key target of Dingxuan Decoction for the treatment of cervical vertigo.GO and KEGG function enrichment analysis were carried out to further analyze the molecular mechanism of the treatment of cervical vertigo.Results：A total of 350 targets corresponding to the active ingredients were extracted from the TSMSP database and the BATMAN-TCM database.In the disease gene database，253 known targets related to cervical vertigo were obtained.After the 2 sets of targets were mapped，21 direct targets of Dingxuan Decoction for cervical vertigo were obtained.After the STRING database was expanded，199 direct and indirect targets were obtained.A total of 99 key nodes were screened out by network topology analysis in Cytoscape，and GO analysis was performed.The results showed that the biological processes of key nodes mainly include cell proliferation，apoptosis，etc.cell components mainly include nuclear chromatin，extracellular space，etc.The molecular functions mainly include enzyme binding，DNA binding and so on.The signal pathways involved were：MAPK signal pathway，PI3K-Akt signal pathway，VEGF signal pathway，etc.Conclusion：The treatment of cervical vertigo with Dingxuan Decoction has the characteristics of multiple components and multiple targets.The key targets，biological processes and signaling pathways involved in the action of Dingxuan decoction are preliminarily investigated，and it is found that its main functions might be to affect bone balance，regulate bone metabolism，promote vascular repair and regulate the process of related inflammation.

Keywords Dingxuan Decoction; Cervical vertigo; Network pharmacology; Molecular mechanism; Signal pathway; Biological process; Bone metabolism; Vascular repair

中图分类号：R289.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.10.001

颈性眩晕（Cervical Vertigo，CV）是指由于劳损、退变等诸多因素，机体出现颈椎椎体结构异常、交感神经兴奋、椎动脉病变等病理变化，从而在颈椎活动过程中产生以眩晕为主的症状，大部分患者可伴有头痛、恶心呕吐，更有甚者出现短暂性发作性意识障碍或跌仆等症状的临床综合征[1-2]。据研究显示，颈性眩晕在我国成人中发病率为17.3%[3]，随着现代社会“低头族”的增多，颈性眩晕的患者年龄逐渐年轻化。因其发病率较高，患者头晕恶心明显，影响生命质量。

临床上常以半夏白术天麻汤治疗CV[4-6]，中药复方定眩汤（川芎、黄芩、延胡索、葛根、石菖蒲、天麻、白术、半夏、钩藤、白芷）是中国中医科学院首席研究员朱立国教授在半夏白术天麻汤基础上根据经验加减而成，此方治疗颈性眩晕效果显著，能有效改善患者眩晕症状，提高患者生命质量。但定眩汤成分较多，同时中药又具有多成分、多靶点和系统调节的特点，基础实验研究很难展现中药复方全面系统的作用。而网络药理学能够运用现代网络技术，从多角度、多靶点的层面上分析中药复方可能的作用机制[7]。因此借助网络药理学的思路筛选定眩汤组成药物的有效活性成分及靶点，分析其治疗CV的关键靶点和信号通路具有重要意义，可为后续的进一步研究指明方向。

1 资料与方法

1.1 数据库与软件 在中药成分检索中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）数据库、BATMAN-TCM数据库中查询并筛选定眩汤的组成成分及相对应的靶点;在疾病数据库（DRUGBANK数据库、OMIM数据库、GeneCards数据库）中查询并筛选与颈性眩晕有关的基因;在Uniport数据库中对蛋白质进行标准化;在STRING数据库中进行蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析;并运用Cytoscape 3.5.1软件、ClueGO插件进行网络图的构建及数据分析[8]。以上数据库的使用时间截至2019年12月，研究的思路流程见图1。

1.2 定眩汤有效活性成分及靶点的查询与筛选 将除天麻之外的9味中药分别输中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP），将口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）设置为≥30%，类药性（Drug Like，DL）指数设置为≥0.18，在中药分子机制的生物信息学分析工具（Bioinformatics Analysis Tool for Molecular MechANism of Traditional Chinese Medicine，BATMAN-TCM）中搜索天麻（Change Score cutoff to 20 and Adjusted P-value cutoff to 0.05），在Excel表格中记录2个数据库所得信息，并在Uniprot（http：//www.uniprot.org/）中的Uniprot KB數据库以条件为Organism：Homo Sapiens（Human）检索筛选所得靶点的对应基因，并结合相关文献报道最终确定定眩汤的活性成分及靶点。

1.3 定眩汤“复方-药物-活性成分-靶点”网络图构建 将获得的与定眩汤有关的活性成分及靶点导入软件Cytoscape 3.2.1中构建“中药-活性成分-靶点”网络，后运用Cytoscape中的network analyzer功能对此网络加以拓扑分析，以筛选出其中较为重要的靶点。

1.4 已知的CV相关疾病靶点检索 采用“cervical vertigo”为关键词，在国际公认的疾病相关数据库中（其中包括DrugBank数据库、OMIM数据库、GeneCards等）来对CV发病相关靶点进行查询筛选。将查询结果中重复靶点去除，得到与CV发病过程相关的已知靶点。

1.5 定眩汤作用于CV的关键靶点探索 将定眩汤中筛选出的靶点与CV的相关靶点进行映射，将得到的直接靶点在STRING数据库进行靶点的扩充，并删除重复项，筛选后得到定眩汤作用于CV的直接和间接靶点。并将筛选后的靶点进行网络拓扑分析，以明确与CV相关的靶点中较为关键的靶点，并绘制蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络图。

1.6 基因本体（GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）信号通路富集分析 通过STRING数据库对关键靶点的生物过程（Biological Process，BP）、细胞成分（Cellular Component，CC）、分子功能（Molecular Function，MF）进行分析，筛选出P<0.05的富集结果;同时运用Cytoscape 3.5.1软件中的“ClueGO”功能对核心靶点进行KEGG富集分析，得到显著富集的信号通路（P<0.01），并按通路的重要性来绘制饼状图;在分析得出的结果图中，不同的节点表示不同的KEGG通路，相同类型的通路用用一种颜色表示，节点的大小则表示该信号通路的重要性的大小。

2 结果

2.1 定眩汤有效活性成分及靶点的查询与筛选 在TCMSP数据库中，按照OB≥30%，DL≥0.18的筛选条件，经过查找筛选后，在该数据库中找到上述9味中药的有效活性成分共177个。其中半夏13个，白术7个，石菖蒲5个，川芎7个，黄芩36个，延胡索49个，白芷23个，葛根4个，钩藤33个，在BATMAN-TCM数据库中搜索天麻（条件为Change Score cutoff to 20 and Adjusted P-value cutoff to 0.05），共得到23个活性成分，将活性成分所对应的靶点提取，根据Uniprot ID删除重复项，最终共得到定眩汤组成中药的活性成分所对应的350个靶点。

2.2 定眩汤“复方-药物-活性成分-靶点”网络图构建 将与组成中药有关的活性成分及对应的靶基因导入Cytoscape中，制作活性成分和作用靶基因的关系网络图，按DC值的不同对该网络中节点进行分类，筛选出定眩汤中的关键作用靶点。如图2所示，在此Cytoscape网络图中，共342个节点和3 828个联系。

2.3 已知的CV相关疾病靶点检索 选取国际公认的与疾病基因相关的数据库，查找与CV关系密切的已知基因，通过疾病基因相关数据库共搜索到263个疾病相关靶点（其中GeneCards 19个，OMIM 240个，DRUGBANK 4个），去重后得到个253个相关靶点。见图3。

2.4 定眩汤作用于CV的关键靶点探索

2.4.1 定眩汤治疗CV直接和间接靶点的探索 将定眩汤的350个靶点和CV的253个靶点进行映射，共得到21个直接靶点，将21个直接靶点在STRING数据库中的Protein by Name栏目中输入，对每个靶点进行扩充，探究与其相关的靶点，最终筛选高置信度（置信度>0.7）的PPI关系1 598个，去重之后获得199个直接和间接靶点。见图4。

2.4.2 定眩汤治疗CV的PPI网络构建 机体疾病的发生往往受到多通路的网络相互影响，中药的治疗作用不仅仅是对靶点直接进行调控，还存在着间接调控的方式。因此我们可根据PPI关系数据对靶点间的直接和间接联系进行研究。在STRING数据库中以置信度>0.4为条件进行PPI网络的构建，本研究发现定眩汤治疗CV的直接与间接靶点之间的相互联系有3 181种。见图5。

2.4.3 定眩汤治疗CV的关键靶点 本研究对定眩汤治疗CV的PPI网络进行拓扑分析，从而寻找出网络中关键节点，并探究关键节点在网络中重要的作用。通过网络图形化工具Cytoscape对上述网络进行拓扑分析，筛选出其中DC值大于31的关键节点共98个，并在STRING数据库中以置信度>0.4为条件完成相关网络构建。见图6。其中节点间联系共1 878条。

2.5 定眩汤治疗CV基因GO富集分析 在GO富集分析中，生物过程（BP）共1 805个GO条目，排名靠前的主要包括细胞对化学刺激的反应、对脂质反应、细胞增殖的调节、凋亡过程的调控、蛋白质代谢过程的正向调节等;细胞成分（CC）共个84个GO条目，排名靠前的主要包括核染色质、细胞外空间、细胞外区域、胞质部分、质膜部分;分子功能（MF）共168个GO条目，排名靠前的主要包括蛋白结合、RNA聚合酶Ⅱ特异的DNA结合、腺苷酸环化酶活性、鸟苷酸环化酶活性、生长因子受体结合、细胞因子活性等。

2.6 定眩汤治疗CV基因KEGG富集分析 运用Cytoscape 3.5.1软件中的“ClueGO”功能进行信号通路分析，在P小于0.01的条件下，确定了127条相关信号通路，通路之间的关系达到1 459种。其中信号通路主要涉及炎症反应、成骨和破骨细胞分化、血管内皮细胞的修复、激素代谢、脂肪细胞的调节、衰老等方面，富集明显的通路主要是癌症相关的通路、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、松弛素信号通路、趋化因子信号通路、FoxO信号通路、TNF信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、VEGF信号通路等。见图7。

3 讨论

颈性眩晕又被称为椎动脉型颈椎病眩晕，临床上表现为眩晕、恶心等症状，老年患者居多，椎动脉缺血、血管管腔狭窄、动脉粥样硬化等均可导致眩晕的发生[9]。随着现代社会节奏的加快、社会压力的增大、人口老龄化程度的增加，CV发病率逐年递增，且年轻化趋势明显。该病发病机制尚不明确，现代医学认为，CV主要是因为颈椎间盘突出、骨质增生等压迫椎动脉、局部炎症介质的刺激颈交感神经，进而诱发椎动脉痉挛，导致后循环供血不足，出现眩晕、头痛、恶心等症状[10]。在治疗上除运用手术外，可采用针灸、推拿等理疗手段配合服用血管扩张剂、非甾体抗炎药、中药等药物治疗，也取得了良好的临床效果[11]。颈性眩晕在中医学中属于“眩晕”病症。《丹溪心法》中有“无痰则不作眩”的描述;《丹溪心法·头眩》中提到“头眩，痰挟气虚并火”。可得出痰火相结也会导致眩晕的发生。本病在早期及发作期时，症状多表现为实症，病因病机以风、火、痰、瘀为主;临床分型有风阳上扰型、痰浊内阻型、瘀血內停型等。本研究所用的定眩汤以君药天麻定弦熄风，石菖蒲化痰开窍，以臣药半夏燥湿化痰止呕，白术健脾补气，两药相辅，增强化痰之功;佐延胡索、川芎活血止痛，葛根解肌通阳，黄芩清热燥湿，钩藤清热熄风。诸药合用，使湿除痰化，气行血活，受蒙之清窍得以升通，眩晕得安。且课题组前期通过小样本随机对照试验证实，中药口服治疗颈性眩晕较对照组甲磺酸倍他司汀片疗效显著，能够明显改良患者眩晕症状，提高患者生命质量。

本研究通过对PPI分析结果发现，AKT1、TNF、TP53、CXCL8、VEGFA等是中药治疗的核心靶点，AKT1是AKT家族的一员，可调控细胞增殖和生长，与细胞凋亡和能量代谢等细胞过程相关。TP53基因编码的P53蛋白的重要作用是调控细胞分裂和增殖，AKT1与TP53在CV发生发展过程中影响成骨与破骨细胞的增殖与抑制，调控骨质的生长。CXCL8是一个多种细胞来源的趋化因子，可趋化中性粒细胞，对炎症反应进行调节，影响骨与关节退行性疾病的发生发展，同时又参与调控细胞的生长、分化等。TNF为肿瘤坏死因子，分为TNF-α，TNF-β 2种，TNF-α是一种由激活的巨噬细胞产生的能抑制成骨细胞和刺激破骨细胞的细胞因子，研究表明，目前大量TNF-α阻断剂具有减轻炎症反应并改善手术预后的作用，能够使椎间盘退变的进程减慢[12]。因此，在炎症反应中，TNF和CXCL8可能与颈椎间盘退行性病变的发生发展紧密相关，可以减缓由于椎间盘的突出导致的局部炎症反应进程。VEGFA为血管内皮生长因子A，是VEGF家族的一员[13]，VEGFA和VEGFB主要促进新血管的形成，在血管生成、肿瘤生长以及缺血性疾病中起着重要作用[14]，可修复已损伤的椎动脉，恢复脑供血，减轻CV的临床表现。

從GO功能富集分析和KEGG通路富集分析结果来看，定眩汤的作用主要是影响骨平衡、调节骨代谢、促进血管的修复、调控炎症的进程。KEGG富集结果显著的通路是MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、松弛素信号通路、趋化因子信号通路、FoxO信号通路、VEGFA信号通路等，MAPK信号通路调控细胞的增殖、分化，对机体的骨代谢平衡的维持起着重要作用[15]。PI3K能够激活Akt，增加Ras同源基因家族中A的表达量，起到改变细胞骨架的作用[16]。松弛素有保护心血管的作用，可以降低外周循环的血管压力，有研究表明动脉的机械特性和心输出量可通过长时间应用松弛素进行改善[17]。有研究表明FOXOs可提高细胞的抗氧化能力，减缓与年龄密切相关疾病的发展，如癌症、心血管疾病、骨质疏松等[18-20]。在炎症反应组织可找到广泛的趋化因子，趋化因子可以驱使炎症细胞向炎症组织靠近，并参与免疫应答，有研究表明，在骨性关节炎的发生发展过程中趋化因子起了重要作用[21-23]。血管内皮生长因子（VEGF）被认为是血管生成的中枢调节剂[24]，其本质是肝素结合性双价蛋白，是一种与血管生长相关的特异性生长因子，正常生理条件下由中性粒细胞及血小板分泌，在缺氧的环境中则由角质形成细胞和上皮细胞产生[25]，VEGF在维持和恢复血管内皮细胞的完整性中发挥重要作用，同时也可增加侧支循环的血量，起到保护脑供血作用。

综上所述，中药复方定眩汤治疗CV的可能机制有：1）调控颈椎的骨代谢，恢复成骨细胞与破骨细胞的平衡，减轻颈椎骨质的退变;2）在颈椎间盘退变的过程中，常伴有炎症反应，定眩汤能够控制炎症的发展，减轻局部炎症介质的不良刺激，从而减轻椎动脉的痉挛和交感神经的兴奋，改善眩晕的症状;3）同时定眩汤能够增加心输出量，减小周围血管的阻力，增加侧支循环的血量，使椎基底动脉的供血量增大，眩晕的程度减轻;4）定眩汤能够促进血管新生，使由于受到颈椎异常结构的不良影响而受损椎动脉内皮细胞得到修复，恢复局部的正常供血，增加大脑后循环的血量。通过网络药理学中所涉及的现代网络技术手段可以分析药物与疾病靶点的相互网络关系，从而可以推测定眩汤治疗CV的作用机制，为后续的进一步的研究指明了方向，使实验研究更加明确、更加具有目的性，同时筛选出了关键的作用靶点及信号通路，为今后进一步从分子生物学角度进行验证奠定了基础。

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（2020-05-18收稿 责任编辑：杨觉雄）