骨痹汤对膝骨关节炎大鼠软骨中基质金属蛋白酶-13及转化生长因子-β₁的影响

李阳 张丽曼 张立颖 狄生云 王菲 姜雪原

摘要 目的：探讨骨痹汤对膝骨关节炎大鼠软骨基质金属蛋白酶-13（MMP-13）及转化生长因子-β1（TGF-β1）的影响。方法：选择健康SD大鼠40只，建立膝骨关节炎模型，随机分为对照组和观察组，每组20只。对照组造模术后不予治疗，观察组自造模成功后，给予骨痹汤熏蒸治疗，疗程4个周。治疗后，比较每组大鼠痛阈、膝关节周径及膝关节活动度情况。采用免疫组织化学法检测各组大鼠关节软骨中MMP-13及TGF-β1表达变化情况。结果：治疗后，观察组痛阈、膝关节周径及膝关节活动范围比对照组明显改善（P<0.05）;治疗后，观察组MMP-13表达水平明显下降，且明显低于对照组（P<0.05）;治疗后，观察组TGF-β1表达水平明显升高，且明显高于对照组（P<0.05）。结论：骨痹汤可改善膝骨关节炎的疼痛，减少软骨中MMP-13的表达，延缓骨性关节炎的发展，并明显上调TGF-β1的表达，促进软骨修复。

关键词 骨痹汤;熏蒸治疗;骨关节炎;膝关节;基质金属蛋白酶-13;转化生长因子-β1;疾病模型;动物

Abstract Objective：To investigate the effect of Gubi Decoction on matrix metalloproteinase-13 and transforming growth factor β1 in knee osteoarthritis rats.Methods：A total of 40 healthy SD rats were selected to establish knee osteoarthritis model，and randomly divided into a control group and a treatment group，with 20 rats in each group.The control group was not treated after the model making operation，and the treatment group was given fumigating and steaming treatment of Gubi Decoction for 4 weeks.After treatment，the pain threshold，the diameter of the knee joint and the activity of the knee joint were compared.The expression of matrix metalloproteinase-13（MMP-13）and transforming growth factor β1（TGF-β1）in articular cartilage of rats in each group was detected by immunohistochemistry.Results：After treatment，the pain threshold，the diameter of knee joint and the range of motion of knee joint in the treatment group were significantly improved，compared with the control group（P<0.05）; the expression level of MMP-13 in the treatment group was significantly lower than that in the control group（P<0.05）; the expression level of TGF-β1 in the treatment group was significantly higher than that in the control group（P<0.05）.Conclusion：Gubi Decoction can improve the pain of knee osteoarthritis，reduce the expression of MMP-13 in cartilage，delay the development of osteoarthritis，and obviously up regulate the expression of TGF-β1 to promote cartilage repair.

Keywords Gubi Decoction; Fumigation treatment; Osteoarthritis; Knee joint; Matrix metalloproteinase-13; Transforming growth factor beta 1; Disease model; Animal model

中圖分类号：R289.5;R684文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.10.006

骨关节炎（Osteoarthritis，OA）是临床常见的关节疾病，中老年人是高发人群，其中以膝骨关节炎（Knee Osteoarthritis，KOA）是最为常见[1]。随着我国人口老龄化的不断加剧，KOA的发病率不断增高，其具有极高的致残率，给患者的生命质量带来严重影响[2]。KOA的病理基础是关节软骨呈现退行性的病变，临床症状主要表现为膝关节活动受限、疼痛、行走困难，膝关节畸形等[3-4]。早中期KOA可采取非手术治疗，晚期则需要进行手术治疗[5]。早中期若能有效药物治疗，可促进膝关节组织软骨的修复，有效延迟病变进程。西医通常采用口服塞来昔布、布洛芬等非甾体抗炎药物及关节腔注射玻璃酸钠的方式来缓解膝关节疼痛，润滑关节，达到治疗的目的，但长期用药会增加各种不良反应[6]。中医对KOA的治疗方式较多，包括中药内服外用、针灸、推拿、小针刀及中药熏蒸等，均具有一定的疗效[7]。骨痹汤具有补益肝肾及化痰祛瘀的作用，通过熏蒸的方式使药物渗透进膝关节周围，从而更好发挥其作用，达到舒筋通络、活血止痛的作用，并无不良反应[8]。本研究通过对KOA大鼠给予骨痹汤熏蒸治疗，探讨其对软骨基质金属蛋白酶-13（MMP-13）及转化生长因子-β1（TGF-β1）的影响，阐述其治疗KOA的可能作用机制，以期为KOA的治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选用健康SD大鼠（动物批准号：SCXK（京）2018-0021）40只，体质量16～22 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，饲养于清洁级实验室中（室温20～24 ℃，湿度40%～60%）观察3 d后，用于实验。

1.1.2 药物 骨痹汤制作：乳香10 g、没药10 g、艾叶20 g、海桐皮20 g、透骨草30 g、苏木20 g、红花15 g、防风10 g、伸筋草30 g、木瓜15 g、淫羊藿15 g、羌活10 g、独活10 g、川牛膝15 g、泽兰15 g、桂枝20 g。自动煎药机煎煮成70%浓度的中药液保存。

1.1.3 试剂与仪器 二甲苯（批号：190712）、枸橼酸盐（批号：191104）、PBS（批号：190805）、过氧化氢溶液（批号：190415）、DBA试剂盒（批号：190904）、大鼠抗MMP-13（批号：190813）、TGF-β1（批号：191005）以上均由北京欧北生物科技有限公司提供。切片机（Leica，德国，型号：RM2245，），显微镜（OLYMPUS，日本，型号：Olympus IX71），恒温箱（上海医疗器械厂有限公司，型号：ZLHS-80-LS），甩尾测痛仪（成都泰盟软件有限公司，型号：SW-200），自制动物熏蒸装置。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 将40只SD大鼠随机分对照组和观察组，每组20只，适应性饲养1周后，采用单侧跟腱切除法，建立KOA模型。

1.2.2 干预方法 2组大鼠术后均常规饲养，自由活动，对照组不采取任何干预措施，观察组建模成功后第2天，给予骨痹汤熏蒸治疗：将大鼠放入自制动物熏蒸装置进行全身熏蒸，蒸汽温度为40 ℃，1次/d，20 min/次，连续治疗4周。

1.2.3 检测指标与方法 在造模前及治疗4周后，采用热辐射甩尾测痛仪对2组大鼠的痛阈进行测量。造模前及治疗4周后，将2组大鼠膝关节伸展，回缩膝关节，采用量角器测量其伸展至回缩的角度。造模前及治疗4周后，采用无弹性的软皮尺测量大鼠膝关节的周径。

治疗4周后，处死各组大鼠后，取其后肢膝关节股骨端软骨作为标本，放入10%中性甲醛溶液固定，15%EDTA溶液中脱钙、脱水、透明，石蜡包埋后连续切片（厚度：5 μm），采用免疫组织化学染色检测MMP-13及TGF-β1表达情况：将切片并放入60 ℃恒温箱烤片过夜，二甲苯脱蜡，依次放入95%、85%、80%及75%的乙醇中各10 min，蒸馏水浸泡5 min后加入3%过氧化氢溶液50 μL，20 ℃孵育10 min，PBS冲洗3次，加入50 μL的一抗，4 ℃下过夜后，加入二抗，20 ℃孵育10 min，DBA试剂盒显色，放入显微镜下观察，显色后用蒸馏水洗掉，终止显色，采取苏木精复染2 min，中性树胶封片。并以细胞呈棕黄色染色判断为阳性。每张切片随机抽取4个400×高倍镜视野，计算出阳性细胞所占百分比，并进行百分比评分（PP），标准为[9]：1）0分：无阳性细胞;2）1分：阳性细胞百分比<5%;3）2分：5%<阳性细胞百分比≤20%;4）3分：阳性细胞百分比>20%;对染色强度进行评分（SI）：1）0分：无染色;2）1分：淡黄色;3）2分：棕黄色;4）3分：棕褐色。免疫反应评分（IRS）=PP×SI。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件处理数据，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组大鼠的痛阈、膝关节周径及膝关节活动度情况

治疗后，观察组痛阈、膝关节周径及膝关节活动范围比对照组明显改善，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 2组大鼠软骨组织MMP-13及TGF-β1表达情况

治疗后，观察组MMP-13表达水平明显下降，且明显低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），观察组TGF-β1表达水平明显升高，且明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2，图1～2。

3 讨论

KOA是临床最常见的关节性疾病，其病理特点主要表现为软骨下骨硬化、肌肉萎缩无力、滑膜增生、关节囊挛缩、关节软骨不同程度的破坏等[10]。KOA的发病机制主要有自身免疫反应学说、软骨细胞凋亡学说、软骨酶降解学说和软骨机制内的稳态失衡学说等[11]。中医学认为KOA属于“膝痹”“骨痹”“筋痹”等范畴，认为外邪（风、寒、湿等）入侵肌腠、经络及筋骨关节，导致关节损伤，从而引发KOA，多数KOA属于痰湿内阻、肝肾亏虚、气虚血瘀等，多属本虚标实，因此临床治疗多以祛湿化痰，祛瘀化痰及补益肝肾为宗旨[12]。

中药熏蒸是中医的一种治疗方法，具有悠久的历史，其操作简单，适用较广，并有明显的疗效[13]。本研究中的骨痹汤药方中的伸筋草、透骨草、苏木及海桐皮具有舒筋活络，祛风湿的功效;乳香、红花及没药具有止痹痛，理气活血的效果;艾叶具有通痹舒筋，温经散寒的功效;羌活、防风及独活可起到胜湿止痛，祛风解表的功效;淫羊藿具有止痹痛，补肝肾之功效;木瓜可起到缓解筋脉拘挛、风湿痹痛的作用;川牛膝可强筋骨，益肝肾，活血化瘀，通利血脉，利关节，桂枝具有温通经脉，发汗解肌的功效;诸药共用，可起到祛痰湿、补肝肾、通经脉、缓拘挛及止痹痛之效[14-15]。KOA大鼠經过骨痹汤熏蒸治疗后，其痛阈、膝关节周径及膝关节活动范围均明显改善，这可使药效经过热力，快速渗入皮肤，作用于肌体，从而使关节腔内的积液得到消除，减少关节肿胀程度，扩大膝关节活动范围;局部高温可使膝关节部位气血更加流畅，加快血液循环，缓解关节疼痛，达到“通则不痛”的效果。

KOA的发生与多种信号通路有密切关系，相关研究证实，金属蛋白类可抑制软骨组织细胞外基质形成的主要通路，在KOA的发生及发展过程中起到重要作用[16]。MMP-13可参与组织愈合、形态生成及损伤修复等多种正常生理病理过程，其在心血管疾病、癌症及KOA等病变过程中起到促进作用[17]。骨痹汤熏蒸治疗后，KOA大鼠的MMP-13水平明显下降，且比其他大鼠明显，这与相关研究结果相一致[18]，这可能是因为通过骨痹汤熏蒸治疗后，通过热力和药力共同作用下，膝骨关节软骨组织中的MMP-13表达水平下调，使异常激活的细胞外基质蛋白质降解等生物学功能得到有效改善，从而促进病情迅速恢复。

TGF-β1是一种转化生長因子，在软骨细胞的生长、增殖及分化过程中发挥重要作用，对细胞外基质形成、软骨修复重建起到重要的调节作用[19-20]。骨痹汤熏蒸治疗后，KOA大鼠TGF-β1表达水平明显升高，这是因为熏蒸治疗可通过局部良性刺激，可有效调节机体的免疫功能，进而刺激TGF-β1的大量合成与分泌，使其在软骨组织中广泛表达，促进软骨修复。

综上所述，骨痹汤熏蒸治疗，可对KOA大鼠起到活血止痛，过下调MMP-13表达，提高TGF-β1表达水平，促进关节软骨修复，发挥中医药的优势，对KOA具有一定预防和治疗作用。

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（2020-04-08收稿 责任编辑：杨觉雄）