基于液质联用和代谢组学方法分析11种动物类中药脂质成分

2021-08-13 08:52巩晓宇严俊珍张丽陆燕萍陈黎
关键词:代谢物脂质质谱

巩晓宇,严俊珍,张丽,陆燕萍,陈黎

(深圳市龙岗区人民医院 & 香港中文大学(深圳)附属第三医院(筹),深圳 518172)

动物类中药中除去蛋白类,主要的化学物质是脂质成分[1-3],研究比较不同动物类中药中脂质成分的差异,可以鉴别和分类不同来源的动物类中药,同时也可以指导药物作用机制和临床应用研究.因脂类成分参与能量运输、细胞间的信息通讯等,故脂类代谢在动物类样本的生理代谢中占主导地位,其化学成分也是探讨动物类样本化合物特征的重要参考[4-6].本文基于液相-质谱/质谱(LC-MS/MS)检测平台,利用自建数据库,采用MRM(多反应监测)检测模式,对动物类中药中脂质代谢物进行检测定性定量.利用自建多元统计分析流程,对定性定量脂质数据进行差异分析.

代谢组学分析的主要目的是从生物样本中检测出各种特征化合物,通过差异物分析和统计学建模,对样品的特征进行归纳,探索不同生物体样品的特点并进行归类,同时阐明代谢过程的生物学机制.本文选取11个样品,基于实验设计、样本的采集及处理、代谢物提取及代谢物的检测分析鉴定出1050个代谢物.通过获取的代谢组数据,进行代谢物的鉴定与样本数据的质控分析和统计学分析,筛选差异的代谢物,对不同类型的动物类中药进行分类识别、差异物鉴定等,从而对样本的特征进行相关的功能预测和判别.

1 仪器与试剂

LC30A超高相液相色谱仪(日本岛津);6500 QTRAP串联质谱(Applied Biosystems);ACQUITY UPLC HSS T3 C18色谱柱(美国Waters);5427R高速台式离心机(德国艾本德).

甲醇、甲酸铵为分析纯,购于上海化学试剂厂;乙腈、异丙醇为色谱纯,水为纯化水.样品信息详见表1,所有样品均按照国家标准进行鉴定.

表1 样品信息表Tab.1 Sample information table

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备

样品进行冷冻干燥,在液氮环境下研磨成细粉,称量20 mg加入到对应的已编号的2 mL离心管中,加入1 mL脂质提取液[V(甲基叔丁基醚)∶V(甲醇)=3∶1],并放入钢珠,摇匀;用球磨机匀浆,取出钢珠,涡旋15 min 加入200 μL水,涡旋1 min,置离心机中离心(转速12000 r·min-1、4 ℃,10 min);吸取上层清液300 μL,放置在离心管中,浓缩至干,然后加入用200 μL 流动相 B,充分溶解,得到供试品溶液[7-9].

2.2 色谱条件及质谱条件的选择

流动相:A相:乙腈/水(60/40,V/V)(含 0.1% 甲酸,10 mmol·L-1甲酸铵);B相:乙腈/异丙醇(10/90,V/V,含 0.1% 甲酸,10 mmol·L-1甲酸铵),进行梯度洗脱(0~10 min:A相从95%~5%;10~15 min:A相保持在5%;15~18 min,A相从5%~95%).设定流速0.35 mL·min-1,柱温40 ℃,进样量2 μL.

质谱条件:同时采用正离子模式和负离子模式进行检测,离子源温度500 ℃,正离子模式下质谱电压设置为5500 V,负离子模式下质谱电压设置为-4500 V,离子源gas1(GS1)45 psi, gas2(GS2)55 psi,帘气(curtain gas, CUR)35 psi.

数据比对基于自建数据库(武汉迈特维尔公司),数据库的建立基于数千种脂质化合物通过对照品确定保留时间和离子对信息,本文中选择三重四级杆质谱的多反应监测模式(MRM),将所有离子对信息和保留时间信息输入到方法学文件,得到不同样本的质谱分析数据后,对所有物质的质谱信号进行峰面积积分.图1显示的是质控混合样品(将所有动物类中药样品提取液各取100 μL混合)的总离子流图,图2是 MRM代谢物检测多峰图.

图1 11种动物类中药混合样品的总离子流图Fig.1 Total ion current diagram of 11 kinds of animal traditionalChinese medicine mixed samples (a)负离子模式;(b) 正离子模式

图2 MRM代谢物检测多峰图Fig.2 MRM metabolite detection multi peak map(a)负离子模式;(b) 正离子模式

对所有单一动物类中药样品的总离子流图进行分析,可以发现每类样品中均检测出较为丰富的脂质类化合物成分,本文采用相对定量的方法,根据保留时间与离子对信息,对每个化合物成分在不同样本中检测到的质谱峰进行校正.图3展示了随机抽取的代谢物在不同样本中的定量分析积分校正结果,横坐标为代谢物检测的保留时间(min),纵坐标为某代谢物离子检测的离子流强度(cps).结合分离度和信噪比,共鉴定出1050个化合物.

图3 代谢物定量分析积分校正图Fig.3 Integral correction chart of metabolite quantitative analysis图中为随机抽取的代谢物在不同样本中的定量分析积分校正结果,横坐标为代谢物检测的保留时间

2.3 代谢组学分析

单纯从总离子流图上看,不同动物类中药较为相似,而且每种动物类中药中有大量的共有成分,差异离子对信号也多被掩盖,很难进行鉴定和区分.代谢组学分析的目标是通过统计学方法,对样品的整体成分及其分布进行考察,确定样品之间的相关性和差异性,从而达到鉴别区分不同动物类中药、指导生物学分类的目的.以下结合统计学软件,对所有样品中检测到的脂质类化合物成分进行多种代谢组学分析,以鉴别分析,文中相关性图、聚类热图、PCA和OPLS-DA通过Simca-p统计学软件绘制.

2.3.1 相关性图和聚类热图分析

为了考察样品间的相关性,通过对各样品进行层次聚类,去除空值,对每个批次样品的质谱数据进行分析,然后对所有检测出的成分进行积分、匹配和峰强度校正等,得到它们的相关性热图.结果如图4.

图4 样品相关性图Fig.4 Sample correlation diagram(a)包含mix混合样品;(b) 不包含mix混合样品

图4中横纵坐标为各个样品信息,不同颜色代表样品间相关性强弱,红色表示相关性强,蓝色表示相关性弱.图4(a)中3个mix混合样品紧密聚合一起,与预期相符合,表明数据质控符合要求.此外,金钱白花蛇、乌梢蛇、地龙、烫水蛭和紫河车具有较多类似成分,聚为一类;炒九香虫、全蝎和炒僵蚕聚为一类;海马、土鳖虫和壁虎聚为一类.在不同的类型中,也有更为相似的聚类关系,如土鳖虫和壁虎、乌梢蛇和紫河车等,这种相似的成分,也提示在药材疗效和适用性上具有一定的相关性,为药物成分的开发和利用提供有意义的参考.

除了对样品和代谢物两个维度对代谢数据进行了层次聚类,本文还通过色阶热图进行展示,更直观地看出不同类型动物中药中脂质成分的异同、数据分布情况及不同样品的相关性,结果如图5.

图5 样品代谢物的聚类热图Fig.5 Cluster thermogram of metabolites

图5的层次聚类热图是以代谢物相表达量经对数转换后的数据进行聚类,横坐标代表样品信息,纵坐标代表各样品所含代谢物信息;颜色表示相对表达量的高低,红色的为高表达,蓝色的为低表达,可以直观地观察到不同样品的异同.

2.3.2 代谢组数据的PCA分析

PCA分析是把复杂数据进行简化的一种统计学方法,在中药品种鉴定和分类研究上有广泛的应用[10-12].每种动物类中药中检测到化合物数量极大,很难直观地比较,通过PCA方法处理,可以初步了解样品间的分组情形,可进一步考察不同动物类中药中脂质成分整体代谢数据的相关性和差异情况,本文中将鉴定出的化合物作为多元数据集合,得到的PCA分析结果见图6.

图6 PCA分析散点图Fig.6 Scatter plot of PCA analysis

图6中横纵坐标轴分别代表PCA分析结果的前两个主成分.图中每个圆点代表1个样品,圆点距离大小表示样品相似度的远近.从图6中可见:3个混合样品mix01、mix02、mix03很好地聚类到一起,说明样品的质控效果符合预期,由于不同类型的动物类中药样品在平面空间上有不同的分布空间,单纯的PCA分析可以在平面空间上很好地表达物种之间的差异,但同时也存在不同样品较为接近的情况,差异信息不能得到完整表达,例如样品5(乌梢蛇)和样品8(紫河车)显示空间分布较为接近,提示在药物的成分上差异性不明显,药理作用上的相关性也具有探讨价值.

2.3.3 代谢数据的PLS-DA分析及其置换检验结果

为了更准确地判别分析11个样品中具有差异标志物性质的代谢物,对不同的样品进行鉴定,结合前面的样品聚类热图及PCA分析结果,对该代谢数据做PLS-DA分析.PLS-DA是多变量数据分析技术中的判别分析法,用来处理分类和判别问题.通过对主成分适当的旋转,PLS-DA可以有效地对组间观察值进行区分,并找到导致组间区别的影响变量.分组情况如下:组别1:QX-2、CJC-9、CJXC-10、TBC-4;组别2:JQBHS-3、WSS-5、ZHC-8;组别3:DL-1、TSZ-7;组别4:BH-6、HM-11.结果见图7.

图7 PLS-DA分析散点图Fig.7 Scatter plot of PLS-DA analysis

图7中横纵坐标轴分别代表PLS-DA分析结果的前两个主成分.图中每个圆点代表1个样品,圆点距离大小表示样品相似度的远近.不同颜色表示不同分组信息.由图7可见:采用上述分组处理,可以较好地把11个样品聚合成4类.

为了验证该PLS-DA模型分类效果是否理想,采用置换检验进行验证,结果见图8.置换检验可以有效地避免过拟合现象,更准确的评估分类模型是否与实际相符,R2 接近1,模型与样品数据匹配性更好,Q2 接近1,说明如果有建立的模型具有扩展性,新的样品也可以按照类型匹配归类,该方法对样品之间的差异进行了很好地诠释.随着置换保留度逐渐降低,R2和Q2均逐渐下降,说明原模型不存在过拟合现象,表明模型的耐受性与稳健性良好.

图8 置换检验分析Fig.8 Permutation test analysis

以上结果表明:11种动物类中药按照化学成分的异同,通过PLS-DA方法分为4类,其验证结果具有合理性,全蝎、炒僵蚕、炒九香虫、土鳖虫为一类;金钱白花蛇、乌梢蛇、紫河车为一类;地龙与烫水蛭为一类;壁虎与海马为一类.这和普通的动物学分类不完全相同,成分上的相似性,对应药理活性和作用机制上,也必然存在一定的关联,在药物分析研究中,可以从同类型的动物中药样品中研究探讨共同的化学物质基础,例如乌梢蛇和紫河车在物质组成和分类上极为相似,提示在挖掘对于动物类中药的活性成分研究上,可以关联分析分析;全蝎、炒僵蚕、炒九香虫、土鳖虫具有同类型的化合物较多,提示药理活性上具有一定的相似性;壁虎与海马,虽然来源不同,但化合物类型相似,可以作为替代品种进行对比研究.

3 讨论

本文通过液质联用技术对比分析了11种动物类中药中化合物成分,按照代谢组学的方法,共鉴定出样品中上千种化学成分,同时基于统计学分析方法,对不同动物类中药之间的亲缘关系进行了分析和验证.代谢组学的分析方法,基于样品中大量物质(离子对)信息进行综合判断,由于动物类中药的药理作用和脂质类化学成分具有相关性,代谢组学的分析和传统的生物学分类不完全相同,这对于阐明药物的生物学药理机制、发现药物活性成分及合理用药上提供了新的思路[13-15].

通过代谢物分析,也可以阐明不同的炮制工艺对化学成分的分布和差异的影响[16-17],炒制后的动物类中药化学成分上具有较强的关联,如炒僵蚕和炒九香虫等,这表明脂质代谢分析,对于动物类中药的炮制工艺研究也具有很好的参考价值.炒制后的动物类中药和一些净制加工的动物类中药也具有关联性,这对于动物类中药的合理炮制也提供了参考依据.

动物药材一般是整体入药,脂质成分和蛋白类成分是主要的物质基础,除了对样品的分类和鉴定具有重要的意义,在药理作用上也是主导作用,但不可忽视动物药材中其他小分子代谢物,如有机酸类、挥发性成分等对药理作用的影响,需要根据每类物质的相对含量,确定不同成分在药物活性的分析中的权重.

由于脂质成分物质类型极为丰富,实验中为了达到最佳的质谱分析效果,对色谱条件进行了多次优化,不同类型相对差异实验中也对流动相体系做了相应的考察,加入0.1%甲酸和10 mmol·L-1甲酸铵能有效改善色谱峰型,乙腈、异丙醇和水的梯度洗脱程序,可以分离出更多的脂质成分,同时可以增加柱效,能让物质分离过程中充分的展开.

以上的分析数据基于11种动物类中药进行了初步尝试,实验中的样本数量和品种偏少,但表明代谢分析方法对于动物类中药的研究有很好的参考价值,下一步将继续增加样品数量和品种,便于更为准确地研究动物类中药的特性.

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