基于网络药理学探讨桂枝茯苓丸治疗子宫内膜异位症的作用机制

金芬，周英惠，张吉，郭伟堃

广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 530001

子宫内膜异位症（endometriosis，EMT）指具有生长功能的子宫内膜组织（腺体和间质）出现在子宫内膜腔被覆黏膜及宫体肌层以外的雌激素依赖性疾病［1］。育龄期是子宫内膜异位症的高发年龄，子宫内膜异位症的患病率为9.5%，25%～40%不孕患者与此病有关，20%～90%慢性盆腔疼痛及痛经患者存在子宫内膜异位症［2-3］。子宫内膜异位发病机制至今尚未明确，治疗方法有局限性。该病的发生率呈明显上升趋势，患者经常出现如月经间期出血、痛经、性交疼痛、大便困难和尿痛等［4］。因此，积极防治子宫内膜异位症的发生，减轻和控制疼痛，治疗和促进生育对育龄期妇女的身心健康具有重要的意义。

中医学认为，子宫内膜异位症的异位内膜有周期性地出血，属“离经之血”，其病位在下焦，女子胞。《血症论》“既然是离经之血，虽清血、鲜血，亦是瘀血”。因此，子宫内膜异位症最基本的病理基础为血瘀。桂枝茯苓丸出自《金匮要略·妇人妊娠病脉证并治》，具有活血化瘀、缓消癥块之功效。研究表明，桂枝茯苓丸能抑制异位内膜血管生长［5-6］，使异位内膜萎缩、坏死［7］，缓解疼痛［8-9］，提高妊娠成功率［10］，对子宫内膜异位症的治疗具有明显疗效［11-13］。

本研究运用网络药理学探讨桂枝茯苓丸治疗子宫内膜异位症的作用机制，阐明桂枝茯苓丸中药物的物质基础和作用机理，为临床使用桂枝茯苓丸提供数据支持。

1 资料与方法

1.1 桂枝茯苓丸的分子化合物及靶点通过中药系统药理数据库和分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP；http：//tcmspw.com/tcmsp.php）检索桂枝茯苓丸所包含的5味中药，即桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁、赤芍中各味中药的分子化合物，筛选符合生物利用度（oral availability，OB）大于30%，类药性（drug-likeness，DL）大于0.18的候选药物分子化合物，获取候选分子化合物对应的作用靶点，整理后导入Excel表格。

1.2 子宫内膜异位症相关靶点通过OMIM（https：//omim.org/）数 据 库 及GeneCards（https：//www.genecards.org/）数据库以“endometriosis”作为关键词检索子宫内膜异位症的相关靶点，将得到的靶点信息保存在Excel表格，合并后去除重复，得到子宫内膜异位症的相关靶点。

1.3 中药-疾病-靶点网络和蛋白相互作用网络用R软件将中药靶点及疾病靶点的靶点名称转换为对应ID，去除重复的靶点，得到中药预测靶点数据集与子宫内膜异位症相关靶点数据集，进行映射，两者取交集后所得的重复靶点视为桂枝茯苓丸作用于子宫内膜异位症的预测靶点，并绘制venny图。运用STRING软件构建蛋白相互作用网络（protein-protein interation，PPI），应用Cytoscape软件构建桂枝茯苓丸与子宫内膜异位症的中药-疾病-靶点网络，然后进行拓扑分析获得自由度大于2的核心蛋白，并选取前30个核心蛋白绘制柱状图。

1.4 GO及KEGG富集分析使用GO数据库及KEGG数据库对方药的关键靶点进行基因功能及靶点通路分析，以“P＜0.05，基因数≥10”作为节点，得到桂枝茯苓丸治疗子宫内膜异位症可能性较大的基因功能及作用机制通路。

2 结果

2.1 桂枝茯苓丸筛选出的分子化合物以OB大于30%，DL大于0.18作为筛选条件，经筛选得到桂枝7个化合物，茯苓15个化合物、牡丹皮11个化合物、桃仁23个化合物、赤芍30个化合物，删除重复化合物，共得到76个候选化合物。

2.2 桂枝茯苓丸中分子化合物相关的靶基因桂枝茯苓丸共有238个验证靶点及272个预测靶点，使用R软件将靶点名称转换为对应ID，去除重复ID的靶点后，得到184个药物靶点，共获得1 403个子宫内膜异位症的相关靶点。

2.3 构建中药-靶点-疾病网络和PPI网络得到桂枝茯苓丸有效成分及靶点、子宫内膜异位症各靶点的关系即药物-靶点-疾病网络（图1），筛选出桂枝茯苓丸作用于子宫内膜异位症的有效成分有endometriosis、（-）-taxifolin、guizhifulinwan、betasitosterol、sitosterol、（＋）-catechin、ent-epicatechin、taxifolin、mairin、kaempferol等共38种，这些化合物作用于PTGS1、PTGS2、PGR、NCOA2、SLC6A4、OPRM1、BCL2、BAX、CASP9、JUN、CASP3、CASP8、PON1、MAP2等135个疾病靶点。映射构建PPI网络（图2），得出99个有效靶点，共1 747条相互作用关系，平均自由度为35.3，聚合系数为0.9。节点的自由度表示在蛋白相互作用网络中与节点直接相互作用的节点数目，节点的自由度越大，则其参与的生物功能越多，其生物学重要性越强。经过对蛋白互作网络进行拓扑分析，选取自由度为前30的蛋白作为核心蛋白，得到AKT1、IL-6、VEGFA、JUN、MAPK8、PTGS2、CASP3、EGF、MAPK1、EGFR等30个Hub蛋白（表1）。

图2 桂枝茯苓丸靶点蛋白互作网络

表1 Hub蛋白

图1 桂枝茯苓丸-靶点-子宫内膜异位症网络

2.4 靶基因相关的功能及通路富集分析通过GO分析探讨桂枝茯苓丸治疗子宫内膜异位症预测靶点的功能分布，富集通路共120条。其中预测靶点的分子生物功能有：染色质结合（chromatin binding）、蛋白质异二聚体化活（protein heterodimerization activity）、细胞因子受体结合（cytokine receptor binding）、辅助因子结合（cofactor binding）和近端启动子序列特异性DNA结合（proximal promoter sequencespecific DNA binding）等靠在前列。通过KEGG通路探讨桂枝茯苓丸治疗子宫内膜异位症预测靶点的通路分布，富集结果包括：人类巨细胞病毒感染（human cytomegalovirus infection）、卡波西肉瘤相关的疱疹病毒（kaposi sarcoma-associated herpesvirus）、糖尿病并发症的AGE-RAG信号通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、乙型肝炎（hepatitis B）、流体剪切应力和动脉硬化（fluid shear stress and atherosclerosis）、丙型肝炎（hepatitis C）、P13K-Akt信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）、前列腺癌（prostate cancer）、白细胞介素-17信号通路（IL-17 signaling pathway）、肿瘤坏死因子信号通路（TNF signaling pathway）等共150条。

功能富集（图3）及通路富集（图4）结果排在前20条通路以气泡图直观表示，节点的颜色与大小由相关联基因的数量和P值决定，颜色从蓝色到红色反应P值从大到小，节点从小到大反映了相关联基因的数量从少到多。

图3 CO分析气泡图

图4 KEGG富集通路气泡图

3 讨论

桂枝茯苓丸为复方中药，具有多成分、多靶点、多系统调节的特点。由Hopkins［14］提出的网络药理学研究方法，可以构建中药复方-中药-有效成分-药物靶标网络，预测中药中多靶点相互作用效果以及中药复方的药效物质基础。本研究通过网络药理学方法检索筛选出药物及疾病相关靶点，并对靶点进行通路富集分析，预测桂枝茯苓丸治疗子宫内膜异位症的有效成分、靶点及相关信号通路。

桂枝茯苓丸由桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁、赤芍5味中药组成。方中桂枝温通血脉，牡丹皮、芍药凉血散瘀，桃仁破血消癥，茯苓渗湿祛痰，运用此方治疗子宫内膜异位症，具有活血化瘀、缓消癥块的功效。本研究筛选出桂枝丸的有效成分及靶点后，与子宫内膜异位症的疾病靶点取交集，并通过构建PPI网络得出有效靶点，并筛选出AKT1、IL-6、VEGFA等30个核心蛋白，参与多种生物调节过程，主要包括物质代谢、细胞增殖、分化、迁移、转化和程序性细胞死亡、血管生成、免疫调节等相关。通路富集分析发现这些靶点的分子生物功能120条及所在的生物通路150条，发现其治疗子宫内膜异位症可能主要通过抑制炎症反应、抗血管生成、抑制细胞增殖、阻滞细胞周期、抗肿瘤等机制。在上述信号通路中，AGE/RAGE信号通路主要与抑制炎症反应相关。糖基化终产物（advanced glycation end products，AGEs）的主要受体称为糖基化终产物受体（RAGE或AGER），属于免疫球蛋白超家族，被称为模式识别受体。AGE/RAGE信号通路可激活多种细胞内信号通路，包括NADPH氧化酶、蛋白激酶C和MAPKs，进而导致-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）活化。NF-κB是一种几乎存在于所有细胞类型的多效性转录因子，是一系列信号转导事件的终末点，可促进促炎性细胞因子如IL-1、IL-6、TNF-α［15］和多种动脉粥样硬化相关基因的表达，包括VCAM-1、VEGF和RAGE。此外，通过RAGE诱导JAK-STAT介导的通路和PI3K-Akt依赖通路，分别参与细胞增殖和凋亡。其治疗子宫内膜异位症可能通过抑制NF-κB、IL-6、IL-8及CCL2等趋化因子，从而抑制炎症反应。已有相关临床及实验研究证实，桂枝茯苓丸可通过抑制炎性因子分泌阻断单核巨噬细胞活化及炎性浸润，减轻异位子宫内膜细胞的黏附、增殖及纤维合成［16-19］，进而延缓疾病的进展。

本研究中多个信号通路如Human cytomegalovirus infection、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、Fluid shear stress and atherosclerosis等均涉及VEGF表达，VEGF为血管内皮生长因子，在血管生成和内皮细胞生长中起作用，其诱导内皮细胞增殖、促进细胞迁移、抑制细胞凋亡、诱导血管通透化。桂枝茯苓丸可能通过降低VEGF表达［20-21］、抑制血管生成［22］、阻碍子宫内膜异位病灶区生长，达到延缓子宫内膜异位症的发展，这与林立鹏等［23-24］的研究一致。从桂枝茯苓丸治疗子宫内膜异位症相关通路，如Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection、Prostate cancer、Colorectal cancer等通路中，桂枝茯苓丸治疗子宫内膜异位症还可能通过细胞周期阻滞、抑制细胞分化、抗肿瘤等机制。通过调控肿瘤相关信号通路中JUN、p21、原癌基因（Myc）、细胞周期蛋白D1（cycD1）等分子活性，从而调节转录、细胞信号转导、增殖［25-26］、分化和凋亡，抑制子宫内膜组织的生长［27］。

综上所述，本研究从分子水平上探讨了桂枝茯苓丸治疗子宫内膜异位症主要活性成分和潜在的分子作用机制，为后续该药物的药效物质基础研究、质量控制提升及作用机制的研究提供理论依据。