牛病毒性腹泻病毒Npro基因克隆、生物信息学分析及其表达鉴定

王丽，马骏，吴陈华，黄雯静，高丽，付金蕾，赵童，刘思雨，岳山，刘宇，翟军军，朱战波

1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江 大庆 163319；2.黑龙江省牛病防控工程技术研究中心，黑龙江 大庆 163319

牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea viruses，BVDV）属于黄病毒科瘟病毒属成员，主要导致牛腹泻、白细胞减少、持续性感染、免疫抑制、产奶量降低和生殖问题等［1］，该病呈世界性分布，给养牛业造成了巨大的经济损失［2］。BVDV为单股正链RNA，通常基于5′-UTR序列、基因组N-端自身蛋白酶（Npro）或包膜糖蛋白（E2）区域分为BVDV-1和BVDV-2型［3］。有报道，第3种遗传物种BVDV-3被描述为非典型的BVDV［4］。BVDV-1进一步分为21个亚型（1a～1u），BVDV-2分为3个亚型（2a～2c）。目前中国主要流行8个亚型：1a、1b、1c、1d、1m、1o、1p和1q［5］。

BVDV基因组包括4种结构蛋白（C、E0、E1和E2）和8种非结构蛋白（Npro、P7、NS2-3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B）［6-7］。Npro蛋白为ORF中编码的第1种蛋白质，具有蛋白酶活性，可从多聚蛋白链上自我裂解下来发挥作用，其Cys69和His130是蛋白酶活性中心的2个位点，可催化Tyr164和Vail65间肽键的断裂。Npro蛋白在瘟病毒属中具有高度的保守性，可通过比较分析该基因序列对BVDV及瘟病毒属其他成员的种、群、型进行确定［8］，但目前尚不能完全解释其蛋白水解作用及免疫抑制机理。本文对BVDV Npro基因进行扩增、生物信息学分析、原核表达及免疫原性检测，旨在为研究Npro蛋白的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 病毒株、菌株、细胞及质粒 BVDV-1 NADL株、E.coli DH5α和BL21（DE3）感受态细胞、pET-28a质粒、pcDNA3.1-Npro质粒、pcDNA3.1空载体、293T细胞均由黑龙江八一农垦大学动物传染病病原学与生物安全实验室保存并提供；pMD18-T购自宝日医生物技术有限公司。

1.2 实验动物 SPF级昆明小鼠，6周龄，雌性，体重18～20 g，购自吉林省实验动物中心，动物合格证号：SCXK2016-0006。……