基于主客体作用的氟硼二吡咯超分子荧光调控及细胞成像应用

李星宇，旷桂超

（中南大学粉末冶金研究院，湖南长沙 410083）

超分子化合物是一类由非共价键作用力形成的复合物。由于非共价键作用具有动态可逆性，使得超分子化合物可以对外界刺激做出响应。BODIPY（氟硼二吡咯）作为一类传统有机染料，具有许多优异的光物理性质，如高荧光量子产率、高摩尔消光系数、稳定的荧光发射等，并且由于其低细胞毒性与多位点易于修饰的特性，BODIPY 在细胞成像中也有十分广阔的应用前景。

本文合成了一种8 位萘亚甲基吡啶鎓盐修饰的BODIPY 衍生物（Naph-BDP）。通过主客体作用和静电力作用，与葫芦脲（CB）成功构筑了一种新型Naph-BDP/CB 超分子化合物，采用等温滴定量热、荧光光谱、核磁滴定、扫描电镜等测试方法表征了超分子化合物的结果及光物理性质。结果表明，通过改变主客体之间的摩尔比，可以有效调控超分子化合物的荧光强度及聚集体形貌。进一步理论分析表明，在超分子化合物形成过程中，客体分子与主体分子存在的静电作用及分子间电荷转移是提高荧光发射的主要原因。最后，成功将该新型超分子化合物应用在细胞成像中。

1 实验部分

1.1 药品和仪器

2，4-二甲基吡咯，AR；三氟乙酸；三氟化硼乙醚溶液，AR；N，N-二异丙基乙胺，AR；4-吡啶甲醛，AR；2-溴甲基萘，AR，上述均为萨恩化学技术（上海）有限公司；葫芦脲（CB），AR，西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；甲苯，AR，国药集团化学试剂有限公司。

RCT Basic 型磁力搅拌器，德高 IKA 集团；BUCHI R-210 型旋转蒸发仪，瑞士 BUCHI 公司；CP124C 型电子天平，奥豪斯仪器有限公司；Bruker Avance 400 Hz核磁共振波谱仪，德国 Bruker 公司；Nano SEM 230 型扫描电子显微镜，荷兰Nova 公司；Hitachi U-5100型紫外可见光光度计，日本日立公司；Hitachi F-2700型荧光分光光度计，日本日立公司；FV1000 型共聚焦显微镜，Olympus 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 化合物Naph-BDP的制备（图1）

图1 化合物Naph-BDP的制备流程

化合物1: 根据文献[9]合成了化合物1 并得到红色晶体状固体产物（产量177 mg，产率27%）。H NMR（CDCl）δ 8.78（dd，J = 4.4，1.5 Hz，2H），7.30（dd，J =4.3，1.6 Hz，2H），6.00（s，2H），2.55（s，6H），1.40（s，6H）。

化合物Naph-BDP：将化合物1（324 mg，1 mmol）与二溴甲基萘（343 mg，1.67 mmol）溶解于甲苯（200 mL）中。在N保护下，该混合溶液加热至120℃并持续回流48 h。溶液冷却后，将沉淀物过滤并将残余物用甲苯（200 mL）洗涤。在40℃下真空干燥后，获得红色粉末状固体产物（产量456 mg，产率86%）。H NMR（DMSO-d）. δ 9.45（d，J = 6.7 Hz，2H），8.50（d，J = 6.7 Hz，2H），8.02（d，J = 8.5 Hz，2H），7.97- 7.82（m，3H），7.65- 7.55（m，3H），6.28（s，2H），6.14（s，2H），2.47（s，6H），1.39（s，6H）.C NMR（DMSO-d），δ 156.9，151.3， 146.5， 142.4， 134.7， 132.9， 132.7， 132.0，129.1， 129.0， 128.8， 128.0， 128.0， 127.8， 127.2，127.1，125.3，122.5，63.8，40.1，40.0，39.9，39.8，39.7，39.6，39.4，39.2，39.1，14.8，14.4 ppm. ESI-MS m/z（CHBBrFN），calculated（M-Br）: 466.226 1，found:466.226 1。

1.2.2 化合物Naph-BDP与CB主客体实验

取不同质量的CB溶解于相同浓度的Naph-BDP 的水溶液，形成一定比例梯度的Naph-BDP/CB 紫外荧光与一维核磁的待测液。

2 实验方法

2.1 超分子化合物Naph-BDP/CB结构分析

如图 2 所示，在 Naph-BDP 水溶液中，添加 CB 进行滴定实验，可以计算出Naph-BDP/CB 的超分子复合物的摩尔比为2∶1，结合常数为4.3×10M。

图2 Naph-BDP 与CB 等温滴定量热曲线（上）与TWO-SET模型拟合获得热力学参数（下）

为了探究Naph-BDP/CB 的超分子复合物结构，配制系列摩尔比的混合溶液进行一维核磁滴定（见图3）。H NMR 滴定结果表明，在Naph-BDP 溶液中添加CB至其摩尔比为1∶0.25时，萘基和吡啶鎓盐基团的上的质子信号会部分宽化并分裂。当Naph-BDP/CB 的摩尔比增加到1∶0.5时，这些信号峰会发生更大的移动甚至消失。但是，当加入更多的CB后，上述信号峰几乎不再发生变化，表明该超分子复合物达到平衡，并进一步证明了Naph-BDP/CB主客体结构的结合比为2∶1。另外，e、f处的质子峰较大程度向高场位移，但氟硼二吡咯基团上的质子峰无明显变化，可以证明当Naph-BDP/CB摩尔比为1∶0.5时，两Naph-BDP分子会在CB空腔内形成结构为萘基和吡啶鎓基团平行重叠的二聚体。

图3 Naph-BDP与CB一维核磁滴定（上）与结构示意图（下）

2.2 超分子化合物Naph-BDP/CB[8]荧光增强分析

配制CB/Naph-BDP 摩尔比分别为10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%系列混合水溶液，并使Naph-BDP 浓度固定不变，在365 nm 波长下激发，得到一系列荧光发射图谱（见图4）。

图4 水中不同摩尔比的复合CB/Naph-BDP的荧光光谱

从图4可知，当CB摩尔比增加时，超分子化合物的荧光强度增强，并且当Naph-BDP/CB 摩尔比为1∶0.5时，荧光强度增强基本停止，这说明Naph-BDP/CB 的超分子复合物的摩尔比为2∶1，即一个CB 主体分子两个Naph-BDP 客体分子相结合。由此可以推测，荧光增强的原因可能是静电力与主客体双重作用的结果。CB外围的高电负性羰基会中和吡啶鎓盐的电正性，从而减弱氟硼二吡咯基团到吡啶鎓盐基团的电荷转移，进而增强了氟硼二吡咯基团的本征发光，即图4 中550～600 nm的荧光发射。另外，CB 环空腔刚好与双萘基的尺寸匹配，有很强的主客体作用。

2.3 超分子化合物Naph-BDP/CB在细胞成像上的应用

分别使用含有Naph-BDP（5 μM）溶液以及Naph-BDP/CB 溶液（摩尔比为1∶0.5）将人直肠癌细胞SW480染色7 h，PBS洗涤细胞3次，同时使用商用染色剂ADPI进行示踪，对细胞进行共聚焦成像，见图5。

图5 细胞成像（上）与荧光强度对比（下）

图5 中，从（a）Naph-BDP（5 μM）和（e）Naph-BDP/CB（Naph-BDP 浓度为5 μM，CB浓度为2.5 μM）的共聚焦图像可得，当细胞内仅存在Naph-BDP 分子时，荧光强度较低，但此时向该细胞中加入CB时，荧光强度显著增加，具有有效的细胞成像功能，这也与在荧光光谱中得到的数据一致。（b，f）为商用染色剂ADPI；（c，g）为明场图像，（d，h）为叠加图，可以发现该荧光超分子有较强的染色能力，同时说明超分子化合物Naph-BDP/CB 在细胞染色与示踪上有一定的应用前景。

2.4 超分子化合物Naph-BDP/CB[8]微观结构调控分析

配制一系列不同摩尔比的超分子化合物Naph-BDP/CB水溶液，喷金后进行扫描电镜测试，见图6。

图6 Naph-BDP:CB 浓度比分别为（a，b，c）10 μM∶2.5 μM;（d，e，f）10 μM∶5 μM;（g，h，i）10 μM∶7.5 μM（j，k，l）10 μM∶10 μM的SEM图像

从图6 可以观察到，当Naph-BDP/CB 摩尔比为1∶0.25 时，超分子化合物聚集成球状，当摩尔比上升为1∶0.5 时，形态转变为纳米球状。而当摩尔比继续提高到1∶0.75 或1∶1 时，超分子结构由球状变化为具有高度结晶性的块状晶体。根据上文的结构表征推测，当Naph-BDP 与CB 形成主客体超分子时，能显著改善该复合物的水溶性，并且当摩尔比为1∶0.5 时，水溶性最佳。而当CB 摩尔比过高时，超分子化合物更多表现出结晶性，从而可以通过改变摩尔比来调控超分子化合物的形貌。

3 结论

（1）本文介绍了一种通过萘基溴化物和内消旋-（4-吡啶基）-取代的BODIPY 之间的N-烷基化反应得到的BODIPY 衍生物分子Naph-BDP，并探究了其与CB结合形成超分子化合物的过程，证明了超分子结合摩尔比为2∶1，结合常数为4.3×10M。

（2）通过改变超分子化合物中主客体的相对含量，可以对其荧光强度及微观结构进行调控，并成功应用在细胞成像中。