基于Syk/Ras/c-fos信号轴探讨miR-324-5p对HBZY-1细胞增殖的影响①

祝晓丽 王晶 秦秀娟 姜辉 高雅晨 高家荣（安徽中医药大学第一附属医院，合肥230038）

慢性肾小球肾炎（chronic glomerulonephritis，CGN）以肾小球损害为主，表现为肾小球系膜细胞的异常增殖和炎症反应［1］。微小RNA（miRNA）是一类内源性的、较小（拥有22~23个核苷酸）的非编码RNA分子［2］。miRNA可影响细胞的多种生物学功能，如分化、新陈代谢、衰老、自噬、增殖和凋亡，因此，miRNA可能是引起CGN发病的一个重要潜在靶点［3-13］。本文采用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导，建立CGN大鼠细胞增殖模型，发现通过下调miR-324-5p表达可促进细胞增殖及Syk/Ras/c-fos通路相关基因的表达，初步探讨了CGN的发病机制。

1 材料与方法

1.1 材料大鼠肾小球系膜细胞（HBZY-1）购自武汉Procell公司；EZ-10 Total RNA Mini-Preps Kit购自上海生工生物工程股份有限公司；ABScripⅡRT Mix for qPCR with gDNA Remover和2×Universal SYBR Green Fast qPCR Mix购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；ERK1/2购自美国Proteintech公司；MEK1/2和p-MEK1/2购自美国Cell Signaling Tech‑nology公司；p-ERK1/2、Syk及Ras一抗购自美国Ab‑cam公司；p-Syk和c-fos一抗购自北京Bioss公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养将HBZY-1细胞接种于含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中，放于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养，取对数生长期细胞用于后续实验。

1.2.2 细胞的增殖情况MTT法检测取对数期的HBZY-1细胞消化得到细胞悬液，接种于96孔板，每孔200 µl，37℃、5%CO2的培养箱中培养24 h，无血清培养基同步细胞24 h，培养不同的时间（24 h、48 h、72 h）后每孔加入20µl MTT溶液，培养4 h后，移去上清，各孔加入二甲基亚砜200µl，振荡10 min溶解结晶物，用酶标仪测量各孔的光密度值（OD490nm）。

1.2.3 细胞凋亡情况流式细胞术检测HBZY-1细胞用不含EDTA的胰酶消化后离心，用预冷的PBS洗2次，加入1×Annexin V结合液重悬细胞，向重悬液中加入5 µl Annexin V-FITC避光静置孵育15 min，加入10 µl PI，混匀，室温避光静置孵育5 min，立即用流式细胞仪检测。

1.2.4 Syk/Ras/c-fos信号轴相关基因mRNA的检测提取总RNA，反转录成cDNA。……