猪繁殖与呼吸综合征病毒污染支原体的清除

胡晓凤，王家福，尹忠良，康 斌，李建林，李少丽

(杭州佑本动物疫苗有限公司，浙江 杭州 310018)

支原体是一类没有细胞壁、高度多形性、能通过滤菌器且可用人工培养基培养增殖的原核生物，大小为0.1 μm～0.3 μm。细胞培养过程中污染支原体是常见问题，常见的支原体有口腔支原体、精氨酸支原体、猪鼻支原体和莱氏无胆甾原体(Acholeplasma Laidlawii)，有的细胞株可同时污染两种以上支原体。当特别重要的细胞株或病毒污染支原体时，要对其清除，最常用且最简便的方法是用抗生素处理。

本研究拟清除猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV)中污染的支原体，旨在保证病毒的纯净性。研究在Mar145细胞培养液中加入支原体清除剂，优化细胞耐受该试剂的工作浓度，在加入清除剂的细胞培养液中接种PRRSV，盲传6代后进行支原体PCR检测，电泳显示支原体阴性，表明PRRSV中污染的支原体得到了彻底清除。

1 试验材料

PRRSV及Marc145细胞(杭州佑本动物疫苗有限公司CNAS检测中心提供)；支原体清除剂(上海碧云天生物技术有限公司)；支原体PCR检测试剂盒(哈尔滨世纪元亨生物科技公司)；0.1 μm滤菌器(美国Millipore公司)；细胞培养瓶及培养板(美国Corning公司)；DMEM培养基(美国GIBCO公司)；胎牛血清(美国GIBCO公司)。

2 试验方法

2.1 Marc145细胞耐受支原体清除剂工作浓度的优化

用含5%胎牛血清的DMEM培养液在6孔板中培养Marc145细胞，分别加入终浓度为10 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL的支原体清除剂，同时设Marc145细胞空白对照孔，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。按照此方法盲传3代，根据Marc145细胞的生长状态确定支原体清除剂的最适工作浓度。

2.2 PRRSV中支原体的清除

在Marc145单层细胞培养液中按照培养液体积3%～5%的比例接种PRRSV，吸附1 h，然后加入25 μg/mL的支原体清除剂，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。……