雪白睡莲花粗提物对奶牛乳房炎主要致病菌体外抑菌和抗炎作用

刘丹丹，罗 洁，向薇薇，况 玲，赛福丁·阿不拉，侯 宇，买占海，张 伟

(新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830052)

乳房炎是奶牛养殖中常发且造成经济损失较大的疾病之一，给畜牧业的发展带来了巨大的威胁[1-2]。奶牛乳房炎发病原因复杂，但由细菌感染引起的较为常见，大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌及链球菌是主要致病菌[3]。从1945年青霉素问世以来，越来越多的抗生素被发现并应用于细菌性疾病的预防和治疗，甚至是用于促进畜禽生长。但随着长时间大量抗生素的滥用，细菌耐药性增强及畜产品中的药物残留等问题的出现，迫切需要毒副作用小、绿色无残留的天然物质替代抗生素。

雪白睡莲花(Nymphaeacandida)是睡莲科睡莲属水生草本植物，在维吾尔医药中有着悠久的药用历史，是维吾尔医学中常用的单方或复方抗病毒药的主要成分，也被推荐用于预防SARS冠状病毒的药物[4-5]。雪白睡莲花有降热止咳、益心护脑、安神止痛等功效，常用于感冒发烧、头痛咳嗽、心悸不安、咽痛解毒等病症的治疗，被收录于《中华人民共和国卫生部药品标准维吾尔药分册》中[6]。近年来，有研究发现该属植物具有抗氧化、抑菌抗炎、抗肿瘤、保肝、降血糖等多种生物活性，但国内外暂未见有关雪白睡莲花粗提物对奶牛乳房炎主要致病菌抑菌效果的报道。为探索雪白睡莲花粗提物对奶牛乳房炎主要致病菌的体外抑菌和抗炎效果，本研究通过牛津杯法和倍比稀释法进行抑菌圈、最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)及最低杀菌浓度(minimum bactericidal concentration，MBC)的测定，探究雪白睡莲花粗提物对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌及链球菌的抑菌效果，采用小鼠耳廓肿胀法探究雪白睡莲花粗提物的抗炎作用，为临床预防和治疗乳房炎新药的开发及自然资源利用提供理论依据和数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及受试菌株 SPF级雄性昆明小鼠，体质量18 g～22 g，购于新疆医科大学实验动物中心；奶牛乳房炎主要致病菌大肠埃希氏菌E3(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌9-14(Staphylococcusaureus)、链球菌151105(Streptococcusagalactiae)，由新疆畜牧科学院兽医研究所提供。

1.1.2 药物与试剂 雪白睡莲花，新疆维吾尔自治区民族医院产品；地塞米松片，浙江仙琚制药股份有限公司生产；胰酪胨大豆肉汤培养基、大豆酪蛋白琼脂培养基，青岛日水生物技术有限公司产品；MH(A)培养基，北京索莱宝科技有限公司产品；二甲苯等其他试剂均为分析纯。

1.1.3 仪器设备 小型粉碎机，北京兴时利和科技发展有限公司产品；电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司产品；三用恒温水箱，江苏省金坛市医疗仪器厂产品；电热恒温鼓风干燥箱，上海齐欣科学仪器有限公司产品；低速离心机，上海安亭科学仪器厂生产；磁力搅拌器，大龙兴创实验仪器(北京)有限公司产品；旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂生产；循环水真空泵，上海亚荣生化仪器厂生产；净化工作台，上海博迅实业有限公司医疗设备厂生产；空气震荡培养箱，北京桑翌实验仪器研究所产品；电热恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司产品；紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司产品；立式高压蒸气灭菌锅，南京庚辰科学仪器有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 雪白睡莲花水提物的制备 取药材粉末10 g，按料液比1∶10加入蒸馏水，恒温水浴回流提取2 h，过滤后向残渣中加入10倍蒸馏水，按上述步骤重复2次，合并3次滤液，抽滤除杂后减压浓缩至1 g/mL，灭菌后4℃封存备用。

1.2.2 雪白睡莲花醇提物的制备 称取药材粉末10 g，按料液比1∶10加入950 mL/L乙醇，恒温水浴回流提取2 h，过滤后残渣中加入10倍950 mL/L乙醇，按上述步骤重复2次，合并3次滤液，抽滤除杂后减压浓缩至1 g/mL，灭菌后置4℃封存备用。

1.2.3 菌液制备 将-20℃保存的大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、链球菌分别接种于肉汤培养基中，37℃恒温培养24 h，后接种于琼脂固体培养基上，37℃恒温培养至相应细菌生长对数期，挑出典型单菌落接种于肉汤培养基中，37℃恒温培养24 h，置4℃保存备用。

1.2.4 抑菌圈测定 按照牛津杯法[7]，取4℃保存菌液0.1 mL，均匀涂布于琼脂培养基上，每个培养基中均匀放置5个牛津杯，杯中分别加入雪白睡莲花水提物、醇提物各0.1 mL，每个药物重复3次，以生理盐水为空白对照组，庆大霉素为阳性对照组。37℃恒温培养18 h～24 h，测量抑菌圈直径。抑菌效果判定：R≥15 mm为高敏，10 mm≤R<15 mm为中敏，8 mm≤R<10 mm为低敏，R<8 mm为不敏感，-表示无抑菌圈。

1.2.5 最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)的测定 采用倍比稀释法进行MIC的测定[8]。在96孔板中每孔加入灭菌肉汤0.1 mL，第1孔中加入浓度0.1 g/mL灭菌受试药液0.1 mL，吹打混匀后取0.1 mL到第2孔，依次稀释到第9孔取0.1 mL弃去。第10孔不加药，第11孔中加受试药不加细菌，第12孔受试药和菌液都不加，作为对照。取0.01 mL菌液分别加入到1孔～10孔，混匀后置于恒温培养箱中培养，观察结果，以肉眼观察未长细菌、溶液未浑浊的最低药物浓度为MIC值。最低杀菌浓度(MBC)：从所有浑浊的培养物中各取0.05 mL接种于琼脂培养基，37℃恒温培养18 h～24 h，平板上生长的菌落数小于5个菌落的最低药物浓度作为MBC[9]。

1.2.6 抗炎试验

1.2.6.1 实验动物分组及给药方案 雄性昆明种小鼠16只，随机分为雪白睡莲花水提物组、雪白睡莲花醇提物组、阳性对照组、空白对照组，每组4只。按分组分别灌胃雪白睡莲花水提物、雪白睡莲花醇提物1.37 g/kg，灌胃地塞米松0.02 g/kg，灌胃蒸馏水10 mL/kg，每天给药1次，连续给药7 d。给药剂量按照实验动物给药剂量换算,计算方法如下：Y mg/kg=W×X mg/kg。X mg/kg为已知A种动物给药量，Y mg/kg为欲得B种动物给药量，W为折算系数，查找动物与人体的每千克体质量剂量折算系数表得。

1.2.6.2 耳廓肿胀检测 给药7 d后0.5 h，将0.02 mL二甲苯均匀涂抹于小鼠左耳致炎，右耳作为空白对照组，1 h后处死小鼠后剪下双耳，用8 mm打孔器取耳片，电子天平称重，观察雪白睡莲花粗提物对二甲苯引起的耳廓肿胀度、肿胀率及肿胀抑制率的影响[10]。计算方法如下：

肿胀度=右耳片质量-左耳片质量；

肿胀率=[(右耳片质量-左耳片质量)/左耳片质量]×100%；

肿胀抑制率=[(空白对照组耳肿胀度-用药组耳肿胀度)/空白对照组耳肿胀度]×100%。

2 结果

2.1 抑菌圈测定结果

由表1可知，雪白睡莲花提取物对3种致病菌均有一定抑菌作用。金黄色葡萄球菌对雪白睡莲花水提物高度敏感，抑菌圈直径达到29.40 mm±0.90 mm；大肠埃希氏菌对雪白睡莲花醇提物中度敏感，抑菌圈直径为14.13 mm±0.76 mm，雪白睡莲花醇提物对金黄色葡萄球菌、链球菌的抑菌效果均较强，抑菌圈分别为21.57 mm±0.85 mm和16.42 mm±0.16 mm。表明雪白睡莲花水提物、醇提物对3种菌抑菌效果差异较大，其中雪白睡莲花水提物和醇提物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最佳。

表1 雪白睡莲花粗提物的抑菌圈测定结果

2.2 MIC和MBC的测定结果

由表2可知，雪白睡莲花水提物对金黄色葡萄球菌的MIC为0.39 mg/mL，MBC为0.78 mg/mL；雪白睡莲花醇提物对3种致病菌的MIC分别为6.25、0.78、0.78 mg/mL，MBC分别为12.5、1.56、1.56 mg/mL。表明雪白睡莲花水提物对金黄色葡萄球菌在较低浓度时就有抑制和杀菌作用；雪白睡莲花醇提物对这3种细菌均有抑制和杀菌作用，其对3种菌的作用效果为：金黄色葡萄球菌=链球菌>大肠埃希氏菌。

表2 雪白睡莲花粗提取物提取物的MIC和MBC结果

2.3 抗炎试验结果

由表3可知，与空白对照组相比，雪白睡莲花水提物组、醇提物对二甲苯所致的小鼠耳廓肿胀均有极显著的抑制效果(P<0.01)，雪白睡莲花醇提物的抑制率优于水提物；与阳性对照组对比，雪白睡莲花水提物、醇提物抑制率大于阳性对照。表明雪白睡莲花水提物、醇提物对二甲苯导致的小鼠耳肿胀均有不同程度的抑制作用。

表3 雪白睡莲花粗提物抗炎试验结果

3 讨论

中药是以自然界的植物、动物和矿物质为主的天然物质，绿色纯天然、成本低廉、易得、种类繁多，具有抗菌消炎、抗病毒、无残留、毒副作用小、无耐药性等特点，还有营养机体、增强免疫的作用。王娟等[10]通过二甲苯致小鼠耳肿胀、角叉菜胶致小鼠足跖肿胀、醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增加及醋酸致小鼠扭体实验、热板试验模型对合萌水提物的抗炎镇痛作用进行研究。结果表明，合萌水提物具有抗炎镇痛作用。赛福丁·阿不拉等[11]通过体外抑菌和二甲苯诱导小鼠耳肿胀法对小檗果水和醇提物对奶牛乳房炎致病菌抗菌活性及抗炎作用进行了研究。结果表明，小檗果水和醇提物具有较好的抑菌及抗炎作用。高瑞娟等[12]通过小鼠乳房炎模型进行了蒙药成分复方治疗效果研究。结果表明，蒙药成分复方能有效治疗细菌性乳房炎。

雪白睡莲花主要产于新疆，在临床上主要用于治疗感冒发热、头痛咳嗽、心悸不安和咽痛等病症，是炎消迪娜儿糖浆、祖卡木颗粒等抗炎抗病毒维药复方的主要成分。据报道，睡莲具有多种生物活性，如抗氧化、抗肝炎、抗肿瘤、抗菌等[13]。姑丽巴哈尔·艾木都拉等[14]、麦尔旦·吐尔逊麦麦提等[15]研究发现，雪白睡莲中睡莲酚、isostrictiniin有较好的抗氧化活性，对氧化应激性肝损伤、急性化学性肝损伤具有较好的的保护作用。Duangjai T等[16]研究发现柔毛齿叶睡莲雄蕊中的黄酮类化合物有较好的抗氧化活性。Maji A等[17]、Batool R等[18]研究发现，红睡莲叶水提物、白睡莲乙醇提取物对大肠埃希氏菌、李氏杆菌有一定的抑菌效果，它们具有对抗体内细菌感染的潜力。Hossain M A等[19]发现，瑞莲提取物能抑制铜绿假单胞菌活性，对革兰氏阴性菌具有浓度依赖性的抗菌活性，但其体外和体内细胞毒性试验均未观察到毒性作用。

本试验通过牛津杯法和倍比稀释法测定药材雪白睡莲花粗提物对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、链球菌的抑菌作用。结果表明，雪白睡莲花醇提物对3种致病菌均具有抑菌作用，水提物只对金黄色葡萄球菌有效。通过抑菌圈直径和MIC、MBC分析，雪白睡莲花水提物和醇提物对金黄色葡萄球菌抑菌效果最好，且水提物抑菌效果优于醇提物，抑菌圈直径分别为29.40 mm±0.90 mm和21.57 mm±0.85 mm，达到高敏，MIC分别为0.39 mg/mL和0.78 mg/mL ，MBC分别为0.78 mg/mL和1.56 mg/mL；醇提物对链球菌抑菌效果优于大肠埃希氏菌，抑菌圈直径分别为14.13 mm±0.76 mm和16.42 mm±0.16 mm，大肠埃希氏菌为中度敏感、链球菌为高度敏感，MIC分别为6.25 mg/mL和0.78 mg/mL ，MBC分别为12.5 mg/mL和1.56 mg/mL。

通过小鼠耳廓肿胀试验，探究雪白睡莲花粗提物的抗炎作用。通过对抗炎试验结果的分析表明，雪白睡莲花粗提物对二甲苯致炎的小鼠耳廓肿胀均有极显著的抑制效果，并且醇提物抗炎效果明显优于水提物，水提物和醇提物抑制率分别为33.67%和68.49%。证实了雪白睡莲花有较好的抗菌、抗炎作用。

综上所述，雪白睡莲花对奶牛乳房炎主要致病菌有一定的抑菌和抗炎作用，其在预防治疗奶牛乳房炎上具有很大的潜力，可以为开发治疗感染相关疾病的新天然药物提供依据。