一起獭兔兔瘟2型病例的诊断

杨泽晓,曾红梅,涂 腾,桑杰益西,李 敏,任永军,罗 燕,姚学萍,王 印*,陈 斌

(1.四川农业大学动物医学院，四川成都 611130；2.成都市动物疫病预防控制中心，四川成都 610041；3.四川省畜牧科学研究院，四川成都 610066；4.四川省动物疫病预防控制中心，四川成都 610041)

兔病毒性出血症(Rabbit hemorrhagic disease，RHD)又称兔瘟，是由嵌杯病毒科(Caliciviridae)兔病毒属(Lagovirus)兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV)引起家兔的一种急性、高度致死性传染病。该病典型病变特征以呼吸系统出血，实质器官淤血、肿大、出血和肝脏坏死为主。RHD因其潜伏期短、发病急、病程短、传播快，病死率可高达100%，被我国列为二类动物疫病[1]。兔瘟包括兔瘟1型(RHD1)和兔瘟2型(RHD2)。RHD1出现较早，自我国1984年报道以后世界很多国家相继出现RHD的发生和流行[1-2]，由于免疫接种等防控措施的实施，RHD1的流行得到基本控制，但偶尔有疑似病例或疫情发生的报道[2-3]，并且不同基因型和抗原型的RHDV变异株不断被发现[4-5]。

RHD2于2010年由法国首次报道，由一种由RHDV新变异毒株兔出血症病毒2型引起的新型兔病毒性出血症(new rabbit hemorrhagic disease，nRHD)即RHD2[6]。RHD2与经典兔瘟病理变化相似，虽然感染试验显示平均病死率只有20%左右，但是感染范围更广，包括一些野兔属品种，可感染致死30日龄以内的家兔和传统兔瘟灭活苗免疫过的家兔[7-9]。

2020年5月初，四川省成都市某獭兔养殖场的獭兔1 200只(母兔300只商品兔和仔兔900只)，陆续出现不同生长阶段獭兔包括母兔、商品兔和仔兔急性死亡病例，症状和病变与兔瘟相似。为确定病情，通过对送检兔场兔群的发病情况调查、送检病死兔只临床剖检和实验室检测与鉴别诊断进行确诊，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病例 四川省某獭兔养殖场送检发病死亡獭兔9只，其中母兔1只，商品兔3只，仔兔5只。

1.1.2 试剂与菌株 DNA Marker DL 2 000、RNAiso Plus Kit，宝生物工程(大连)有限公司产品；EVO M-MLV反转录试剂预混液试剂盒(AG11706)，艾科瑞生物有限公司产品；通用型基因组DNA提取试剂盒(9ZEL15)，构菲特生物有限公司产品；2×TaqPCR Master Mix，成都飞克(天泰)科技有限公司产品；兔巴氏杆菌17株，四川农业大学动检实验室保存。

1.1.3 引物 采用文献[10-11]中RHDV、RHDV2和巴氏杆菌检测引物(表1)，送往成都擎科生物工程有限公司合成，按照合成说明书将其稀释至10 μmol/L,置-20℃冻存备用。

表1 实验室诊断检测引物

1.1.4 主要仪器 台式冷冻离心机(Centrifuge 5418R)，德国艾本德(Eppendorf)公司产品；PCR仪(T100TM)和紫外凝胶成像系统(Universal HoodⅡ)，美国伯乐(Bio-Rad)公司产品；电泳仪(DYY-2C型)，北京六一生物科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 流行病学调查 询问了解兔场饲养管理、兔群发病情况及免疫用药情况，发病临床症状、死亡率等。

1.2.2 病理剖检 按常规方法对送检病死獭兔进行剖检,观察主要脏器的病理变化，并按无菌采取病料进行后续检测和鉴别诊断。

1.2.3 RT-PCR检测

1.2.3.1 RHDV和RHDV2的检测 取采集肝、脾等病变组织混合采用RNAiso Plus Kit进行RNA提取，然后按照EVO M-MLV反转录试剂预混液试剂盒说明书操作进行反转录，反应体系为EVO M-MLV RT Master Mix 2 μL，RNA5 μL， ddH2O 3 μL；反应条件为37℃ 15 min， 85℃ 5 s。参照文献[10]中反应体系和反应条件进行兔瘟病毒基因的检测，同时做阳性对照(RHDV和RHDV2的靶片段重组质粒为模板)和阴性对照(ddH2O为模板)。2×TaqPCR Master Mix 25μL， P1、P2、P3和P4 各1μL，cDNA 3μL，ddH2O 18 μL，混匀后按照以下程序进行扩增：95℃ 5 min；95℃ 40 s，56.5℃ 30 s，72℃ 30 s，35个循环；72℃ 10 min。取5 μL PCR产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳。

1.2.3.2 巴氏杆菌PCR检测 取采集肝、脾等病变组织采用通用型基因组DNA提取试剂盒(9ZEL15)按照说明书进行DNA提取，然后参照文献[12]反应体系和反应条件进行巴氏杆菌KMT1基因检测，同时做阳性对照(兔巴氏杆菌17株为模板)和阴性对照(ddH2O为模板)。2×TaqPCR Master Mix 25 μL， P5和P6各1 μL，模板1 μL，ddH2O 22 μL，混匀后按照以下程序进行扩增：95℃ 5 min；95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 60 s，30个循环；72℃ 10 min。取5 μL PCR产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析。

1.2.3.3 PCR产物序列分析 将PCR阳性反应产物送成都有康生物技术公司进行序列测定，然后进行BLAST分析进行同源性比较。

2 结果

2.1 流行病学调查与临床剖检

兔场发病兔群陆续出现母兔、商品兔和乳兔急性死亡病例，母兔和商品兔死亡率15%左右，乳兔死亡率高达50%以上，严重者乳兔出现整窝死亡；兔场免疫过经典兔瘟疫苗和巴氏杆菌疫苗，发病后抗生素治疗无效。发病兔一般无明显临床症状突然死亡，死亡前呼吸困难，尖叫，抽搐，有的可见鼻孔出血(图1A和图1B)，一般情况下粪便干结(图1C)，少数病例表现拉稀(图1D)。

A、B.口鼻部位的异常变化；C、D.排除粪便的异常变化

剖检病变与经典兔瘟相似，主要以呼吸道出血病变和全身实质性器官水肿和淤血、出血为特征变化。剖检一般可见病死兔膀胱积尿(图2A)；气管环状充血、出血(图2B和图2C)，个别有大量泡沫出现；肺脏点状或片状出血(图2D)，严重者可见心肌出血(图2E)；肝脏质脆，淡黄色(图2F)或瘀血呈紫红色，严重者可见坏死灶(图2G)；脾脏淤血肿大紫红色(图2H)；肾脏淤血肿大(图2I)，严重者可见点状出血(图2J)。

2.2 实验室诊断

对采集的心脏、肝、脾等病变组织混样后提取RNA，反转录后进行进行RHDV和RHDV2的PCR检测，同时抽提样品DNA进行巴氏杆菌的PCR检测。检测结果见图3，RHDV和RHDV2鉴别RT-PCR阳性对照(泳道1)、阴性对照(泳道2)、与巴氏杆菌PCR检测阳性对照(泳道4)、阴性对照(泳道5)均成立，检测样品的巴氏杆菌扩增阴性(泳道6)，仅有RHDV2扩增出约435 bp预期大小的特异性DNA条带(泳道3)。

阳性PCR产物测序结果见图4，经BLAST分析显示，扩增基因核苷酸序列与GenBank(登录号MN061492)RHDV2(RHDV2-NL2016毒株)的核酸同源性最高为98.39%。最终确诊送检病兔为RHDV2感染。

图4 RHDV2阳性RT-PCR产物测序结果

A.膀胱积尿；B、C.气管充血、出血；D.肺脏出血；E.心肌出血；F、G.肝脏肿大质脆；H.脾脏淤血肿大；I、J.肾脏瘀血、出血

2.3 处置与防控

确诊后上报疫情，按照国家疫病防治技术的相关处理规范与要求，进行同群兔扑杀，并做无害化处理和消毒等处置。

M.DNA标准DL 2 000; 1.RHDV-RHDV2复合RT-PCR 阳性对照;2.RHDV-RHDV2复合RT-PCR 阴性对照；3.样品RT-PCR产物；4.巴氏杆菌检测阳性对照；5.巴氏杆菌检测阴性对照；6.样品PCR产物

3 讨论

经典兔瘟自1984年我国报道以后相继在世界很多国家出现，也伴随着陆续出现不同基因型和抗原型的RHDV变异株(RHDVa株)。2010年由法国首次报道发生RHD2，即出现了RHDV新变异毒株兔出血症病毒2型(RHDV2)[6]。继而，RHD2也呈现出向外蔓延趋势，意大利、西班牙、德国、葡萄牙、英国、挪威等多数西欧国家和亚速尔群岛，以及北非和南非一些国家陆续报道了该病的发生[10,13-14]。截止2020年5月底，美国和墨西哥均通报了RHD2疫情，尤其在美国，2019年7月出现RHD2疫情以来又已连续发生15起RHD2疫情，呈现出国内扩散势态[15]。2020年5月21日，我国农业农村部发布了近日四川省金堂县养兔场的RHD2疫情[16]，此前我国从未有过该病发生的报道。RHD2作为我国新发生动物疫病，目前我国除四川省外其他区域尚无该病的发生，加之该病国内尚无商业化疫苗可以用，无有效预防措施，这应该引起人们的高度重视和关注。一方面要追溯发生RHD2疫情的原因，总结经验教训，积极开展RHD2风险分析，加强检疫，严防RHD2等外来病的传入和RHD2疫情在国内的蔓延；另一方面通过科研立项积极进行RHD2防控技术等方面的科技攻关。

本次病例诊断的报告从RHD2在送检兔场成年兔和乳仔兔发病死亡情况，临床症状、病理剖检以及实验室鉴别诊断的情况和方法进行了全面翔实的介绍，以期能为我国养兔场RHD2疑似病例的发现和诊断提供参考，进而做到RHD2的及早发现、及早诊断和有效控制蔓延。