温肾健脾方对脾肾阳虚证腹泻型肠易激综合征大鼠模型肠组织蛋白组学的影响

张喆,李依洁,魏玮,刘瑜,符思,苏晓兰

1.中日友好医院中医脾胃病科，北京 100029；2.中国中医科学院望京医院脾胃病科

腹泻型肠易激综合征(IBS-D)是一组持续或间歇发作，以腹痛、腹胀、排便习惯和(或)大便性状改变为临床表现，而缺乏胃肠道结构和生化异常的肠道功能紊乱性疾病[1]，通过前期研究[2]发现针对IBS-D脾肾阳虚证制定的温肾健脾方中高剂量组通过调节免疫、抗炎、调节肠神经系统运动、改善胃肠道激素紊乱、降低内脏高敏感等方面起到了改善腹泻的作用，本次研究拟通过蛋白组学研究挖掘脾肾阳虚证IBS-D大鼠蛋白质的表达特征及温肾健脾方中、高剂量组可能的干预机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 4周龄(70 g)雄性SD大鼠50只，级别SPF/VAF，许可证号：SCXK(京)2011-0004，购自斯贝福实验动物科技有限公司。恒温(23～25 ℃)饲养，灯光环境和避光各12 h，大鼠自由进食标准颗粒饲料。北京中医药大学屏障环境动物实验室实验动物使用许可证号：SYXK(京)2016-0038。

1.2 主要试剂及仪器 水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司，批号：20140827)；甲醛(北京益利精细化学品有限公司，产品标准编号：YZB/京0099-2011)；番泻叶(北京康美药业有限公司，产品批号：140181491)；尿素(Bio-Rad，货号：161-0731，美国)；蛋白定量染液(Thermo Scientific，货号：23238，美国)；牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)(Sigma-Aldrich，货号：A2058，美国)；Ziptip(Millipore，PN：ZTC18M096(2 μg)。

U-TvO.5xC.24H01726显微镜(OLYMPUS公司)；RM2255切片机(Lejca公司)；H1122Q烤片机(Leica公司)；Eql50H脱水机(Lelca公司)；10K超滤管(Sartorious，PN：VN01H02)；6标TMT®试剂盒(TMTsixplex Label Reagent Set)(Thermo Scientific Pierce，PN：90066)；超声波细胞破碎仪(南京先欧仪器制造有限公司，型号：XO)；酶标仪(Thermo，型号：Multiskan MK3)；真空冷冻干燥机(Thermo，型号：SPD2010-230)；RIGOL L-3000高效液相色谱系统(北京普源精电科技有限公司)；高效液相色谱仪(Thermo Scientic EASY-nLC 1000 System(Nano HPLC)；质谱系统(Thermo，型号：Q-Exactive)。

1.3 药物制备 温肾健脾颗粒剂：肉豆蔻15 g、补骨脂30 g、五味子9 g、吴茱萸9 g、党参30 g、白术15 g、郁金18 g、生姜10 g、大枣10 g。以上药物均购自望京医院，由四川新绿药业科技发展股份有限公司制备为颗粒剂，每剂146 g，经沸水冲溶后置凉使用。

1.4 方法

1.4.1 分组与干预方法 50只SD大鼠，适应性喂养1周后，随机选取10只为健康对照组(N组)，其余各组参考前期研究[3]，以AL-ChaerED[4]的造模方法为基础，同时予番泻叶灌胃联合夹尾刺激，即采用物理化学刺激共同作用的方法制备脾肾阳虚证IBS-D大鼠模型。N组全过程正常饲养，无造模及其他干预。造模大鼠进行为期4周的造模干预后，N组与造模大鼠各随机取1只大鼠行肠道病理组织学观察。再参考存活数量，将造模组剩余大鼠随机分为模型组(M组)、温肾健脾方中剂量组(ZZ组)、温肾健脾方高剂量组(ZG组)和西药组(W组)4组，其中ZZ组、ZG组分别给予3.10、1.55 g·kg-1·d-1的温肾健脾方颗粒灌胃，2 mL/次，2次/d；W组予匹维溴铵(公司名称：Abbott Products SAS，生产批号：635518)以1.61 mg·kg-1·d-1灌胃，2 mL/次，2次/d；M组予等容量蒸馏水灌胃；干预周期14 d。

1.4.2 蛋白质提取、定量 采用Bradford法测定蛋白浓度[5]。蛋白定量后将200 μg蛋白溶液放于离心管中进行蛋白酶切，脱盐后采用Nanodrop测定各样品中肽段的含量。分别取N组、M组、ZZ组、ZG组和W组大鼠距肛缘8 cm以上的结肠组织，每组做3只大鼠为生物重复，采用TMT sixplex Isobaric Mass Tagging Kit(Thermo Scientific)试剂进行蛋白标记，取等量所有实验样品混合样作为参考组Pool样品。将标记后的样品混合，用RIGOLL-3000高效液相色谱系统进行肽段样品预分，共得到15个合并组分。Nanodrop测定每个组分的肽段浓度。使用台式四级杆-轨道阱高分辨质谱仪Q Exactive进行反相色谱串联质谱分析，液相色谱为EASY-nLC1000。质谱原始文件由 Proteome Discoverer(版本1.4.0.288，Thermo Scientific)进行检索，数据库为Uniprot大鼠蛋白质数据库(50 837 个蛋白序列，2013-06)及污染库(215 蛋白序列)。

1.4.3 生物信息学分析 使用DAVID生物信息学资源6.8(https：//david.ncifcrf.gov/)和PANTHER 在线网站，进行Gene Ontology(GO)注释、蛋白的细胞定位和生物学过程等分析，根据P值选取富集显著性排序前十位的注释项。蛋白功能通路利用 KEGG数据库获得。

2 结果

2.1 基本鉴定信息 3次重复试验的数据合并后发现，最终鉴定确定了7 934个蛋白，总肽段数为69 261个，独有的肽段序列数59 350，匹配的图谱数为267 247。

2.2 数据筛选 在每个3次重复试验中，至少2次检测到，同时入选的蛋白需要至少2个独有的肽段序列数；为了提高数目的使用率，对于只有1个独有的肽段序列数的蛋白质，如果该肽段在所有的样品中都能检测到，那么我们也将对该蛋白进行定量分析；经筛选后，列表蛋白缩减为6 523个。然后在感兴趣的组之间做Studentt检验，P<0.05的蛋白认为是差异表达的蛋白，在差异蛋白列表以“+”标出，同时计算出该蛋白ratio的均值和标准差，这样共鉴定到405个差异蛋白。

405个差异蛋白中，以ratio倍数改变>1.2或<0.8，在M组与N组相比的差异蛋白中筛选明显上调或下调的蛋白，共有163个，包括81个上调蛋白和82个下调蛋白；进一步挖掘这163个差异蛋白，确定经治疗后ratio在1.2到0.8之间的蛋白存在回归趋势，筛选后发现ZZ组、ZG组、W组分别有79、18、117个蛋白有回归趋势，即经治疗后蛋白水平与N组相当，包括上调蛋白71个、下调蛋白67个。

2.3 差异蛋白的功能分析 利用 PANTHER 在线软件(http：//www.pantherdb.org/)，针对405个差异蛋白进行功能分析，通过DAVID网站对具有差异的功能分析(P<0.05)进行进一步阐释，包括蛋白质参与的生物学过程(biological process)、分子功能(molecular functions)和细胞定位(cellular components)。分析结果所示，差异蛋白行使的主要生物学功能有：细胞构成或合成、细胞的过程、定位、繁殖、生物调节、对刺激的反应、发展的过程、多细胞生物过程、运动、生物黏附、代谢过程、生长和免疫系统的过程，其中涉及代谢途径、细胞过程、细胞构成和定位方面的达70%以上；示差异蛋白涉及的分子功能主要包括结合及转录调节因子、受体、结构分子、信号转导、通道调节、催化和转运等活性调节功能，其中催化活性、结合、结构分子活性为主要功能，占90%；差异蛋白在细胞定位方面主要定位于细胞连接、细胞膜、大分子复合物、细胞外基质、细胞的一部分、细胞器和胞外区，其中细胞部分、细胞器和大分子复合物占80%以上。

2.4 差异蛋白的KEGG通路分析 采用DAVID网站分析405个差异蛋白在KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路中的富集情况，提示了最相关的6个通路的蛋白数量(P<0.05，且比值>3%)，包括：代谢途径(54)、核糖体(15)、氧化磷酸化(14)、阿尔茨海默病(14)、亨廷顿病(14)和剪接体(11)。

2.5 根据主要通路筛选重点差异蛋白 从6个主要信号通路涉及的差异蛋白中，筛选在M组/N组差异较大(ratio>1.2或<0.8)，并于ZZ组或ZG组治疗后有回归趋势(ratio在1.2至0.8之间)的蛋白，总结其在各组表达的情况。发现共涉及16个差异蛋白：Ugt1a1、Alad、Naprt1、Cox6b1、Mccc2、Naglu、Acss2、Man2a1、Mrpl14、Mrpl12、Mrpl2、Gsk3b、Tgm2、Srsf6、Wbp11和Snrpd2；Naprt1、Naglu、Mrpl2在ZG组表现出回归趋势，除了Naglu的其余15个蛋白均在ZZ组表现出回归趋势：蛋白Cox6b1同时存在于代谢途径、氧化磷酸化、阿尔茨海默病和亨廷顿病4条通路(见表1)。

表1 主要通路中表达重点差异蛋白

3 讨论

本研究所选用的对照西药为匹维溴铵，是一种钙通道阻断性季铵化合物[6]，可改善运动障碍、降低内脏敏感性，是针对IBS腹痛、排便紊乱等不适有公认疗效的解痉药[7]。参照匹维溴铵既往的治疗机制和蛋白组学研究，分析全部405个差异蛋白后发现，ZZ组和W组共同回归的蛋白有65个，占到ZZ组回归蛋白的82.28%，提示了温肾健脾方临床剂量(ZZ组)的治疗机制与匹维溴铵有高度的相似性。

通过研究结果发现从蛋白组学的角度各组差异蛋白主要影响了6条相关信号通路。在分析代谢途径信号通路时，本次实验在该通路主要涉及脂质代谢和多聚糖生物合成与代谢2种。进一步分析后发现，其中有8个蛋白经造模后与正常组出现较大差异并于中药治疗后差异缩小回归正常水平：Ugt1a1、Alad、Naprt1、Cox6b1、Mccc2、Naglu、Acss2、Man2a1，以上这些蛋白与胃肠道肿瘤、胆红素代谢、铅中毒肾损害、脂肪酸合成、肿瘤应激、免疫调节等方面相关性较强，但目前文献中均未发现它们与IBS发病和治疗的相关性研究。氧化磷酸化通路、核糖体通路的相关蛋白与代谢途径信号通路情况类似，相关主要蛋白在目前研究进展中未发现与IBS发病和治疗的明显相关性。

从其他差异蛋白来看可能与脑肠互动和肠道慢性炎症的病理因素相关性较高。本组在分析阿尔茨海默病通路时发现其中的糖原合成激酶-3βGsk3b为丝/苏氨酸磷酸激酶的B型亚基，该基因分布广泛并与多种疾病病机有关，如阿尔茨海默病及帕金斯综合征、肿瘤、骨骼发育和新陈代谢、肥胖和2型糖尿病等[8]。阿尔茨海默病的特征之一是微管相关蛋白tau的异常磷酸化，而GSK3b是引起其磷酸化的重要蛋白——过表达的GSK3b会降低细胞核β-catenin的表达，引起tau的过度磷酸化和大脑神经退行性改变。此外，GSK3b可通过负调控IL-17的信号级联，从而抑制炎症相关通路的因子[9-10]。

基于IBS有脑肠互动和肠道慢性炎症的病理因素，结合本研究中蛋白的表达趋势，推断M组大鼠由于造模影响引起Gsk3b表达增高，考虑可能降低了β-catenin的表达、引起tau的过度磷酸化和脑神经的异常改变；而治疗后该蛋白表达下降，表现出回归正常趋势，可能是通过调控β-catenin的表达，维持了Wnt/β-catenin信号通路的稳定，进一步可保障肠道黏膜和神经系统的稳态，或通过调控IL-17的信号级联，抑制炎症因子的作用，从而减少了肠道炎症。

在亨廷顿病通路中的组织转谷氨酰胺酶2(Tgm2)，产生于小肠上皮细胞，研究证实为乳糜泻和精神分裂症的易感因子。而乳糜泻在IBS患者中的发病率高于健康人4～7倍[11]，而Tgm2引起乳糜泻和精神分裂症的机制均与醇溶蛋白(Gliadin)相关[12]。醇溶蛋白为小麦面筋蛋白的部分组成，其对消化酶具有强耐受性，当机体处于应激、感染等情况时，引起肠道通透性异常，未消化的蛋白片段则进入机体，由于Tgm2与醇溶蛋白有极高亲和力，它通过脱氨基和酰胺基转移等改变了醇溶蛋白片段，继而产生抗Tgm2抗体，醇溶蛋白来源的抗原表位诱发了精神分裂症[13]，具体机制尚不明确，而抗Tgm2抗体导致了乳糜泻。近年来，低FODMAP饮食作为IBS的治疗方式得到公认[14]，其机制正是由于IBS患者腹部症状的产生与醇溶蛋白引起的免疫反应有关。而Tgm2在肠道和神经系统的双重作用，均提示了其在IBS发病中可能存在的重要意义。在本研究中，M组大鼠经历造模中应激等因素的刺激，可能影响了肠道通透性的改变，促进了醇溶蛋白的摄入，引起Tgm2表达上调，增加了抗Tgm2抗体并诱发了相关免疫反应，诱导了IBS的产生；而治疗后Tgm2下调，提示了在减轻免疫应答、减少异体蛋白抗体等方面产生了作用。

IBS为功能性疾病，脑肠互动为其重要病机发现，提示IBS发病过程与中枢神经系统关系密切；因而，基因剪切通路的研究对IBS也意义重大。有研究[15]显示，多聚谷氨酰胺结合蛋白1(pqbp1)为重要的RNA剪切因子，而剪接体通路中WW结构域结合蛋白11(Wbp11)作为其结合因子可约束其突变，防止相关神经系统疾病的发生；同时，这2个基因的表达异常会引起胚胎时中胚层和神经系统的发育异常，并诱发神经系统功能缺陷。另有研究[16]证实，部分敲除小鼠pqbp1基因后发现，其表现出明显的焦虑认知损害和心理发育迟缓，而Wbp11的表达与pqbp1的功能极为密切，甚至认为保证Wbp11功能正常是pqbp1正确表达的唯一关键。除了对神经的调节，Wbp11也调控胃肠道功能的变化。研究[17]发现，NOD2蛋白所属家族可调控肠黏膜与共生菌的炎症反应，该蛋白则有助于先天免疫反应形成和保持肠黏膜平衡。

本次研究中还发现蛋白Cox6b1同时存在于代谢途径、氧化磷酸化、阿尔茨海默病和亨廷顿病4条通路。经药物治疗后该蛋白的下调趋势得以回归，提示了其对IBS中肠神经系统和肠道运动功能可能存在调控影响。

本研究所用温肾健脾方，由肉豆蔻、补骨脂、五味子、吴茱萸、党参、白术、郁金、生姜、大枣组成。从中医理论出发可以补脾胃、化水谷、升清阳、除腹泻，又能充肾阳、固大肠。通过本研究发现ZZ组药物在维持神经稳态方面的突出作用，尤其阿尔茨海默病、亨廷顿病通路的影响更能体现这一点。单纯检索组成药物的研究进展发现，在维持神经稳态方面，肉豆蔻挥发油通过调节五羟色胺及单胺氧化酶有抗抑郁作用[18]，北五味子多糖通过减少脑组织中谷氨酸含量有抗焦虑和镇静催眠作用[19]，而白术多糖具有延缓神经细胞因缺氧复氧而导致细胞凋亡的能力[20]，尽管这些单药在复方结构中与本次研究结果是否存在相关性，但它们仍提示了温肾健脾方在维持神经稳态方面的作用值得进一步研究和验证。