茶氨酸生物转化体系研究

李依韦，朱思琪，宋美慧，代玉坤

（内蒙古民族大学 生命科学与食品学院，内蒙古 通辽028043）

茶氨酸最初是在茶叶中分离出来的一种非蛋白质氨基酸，其方向均为左旋，又称为“L-茶氨酸”［1］.它不但可以作为添加剂，而且还具备多种生理功能［2］.它能够直接对中枢神经产生影响，从而调节人的情绪，影响学习和记忆能力、注意力等，还具有抗肿瘤降血压等作用［3］.近年来，茶氨酸在医疗保健方面的开发更是值得期待，很有可能成为新型安全的天然药品或保健品，其市场发展潜力很大［4］.

化学合成法生产茶氨酸成本低，但是纯化较难，副产物多，安全性无法保证，不适合在食品和医药上应用［5］.植物组织培养法获得茶氨酸对环境条件要求严格且周期长、产率低，不利于产业化生产［6］.而微生物转化法克服了以上2种方法的弊端，是相对合适也是最具有发展前景的方法.这种方法是用γ-谷氨酰转肽酶（γ-GT）和谷氨酰胺合成酶生产茶氨酸，其中，用γ-GT合成茶氨酸的方法最为简单有效.γ-GT是普遍存在于微生物和哺乳动物体内的一个不对称的二聚体酶，为转氨酶的一种.

地衣芽孢杆菌是一种革兰氏阳性菌，繁殖能力快，形成的芽孢多.具有丰富的酶系且产酶量高、耐热、安全性高［7］.本研究利用地衣芽孢杆菌发酵产γ-GT，再根据该酶催化γ-谷氨酰基对硝基苯胺的γ-谷氨酰基转移到双甘氨肽生成对硝基苯胺，来确定γ-GT酶活力.该高活性的酶能将底物谷氨酰胺中的γ-谷氨酰基转移到另一底物乙胺盐酸盐上，发酵转化最终获得茶氨酸.

1 材料与方法

1.1 试验菌种 地衣芽孢杆菌（内蒙古民族大学生命科学与食品学院微生物生物技术实验室保存）.

1.2 试验方法

1.2.1 绘制地衣芽孢杆菌生长曲线 活化好的地衣芽孢杆菌37℃、180 r∙min-1振荡培养.紫外分光光度计每隔2 h在660 nm处测吸光度，建立生长曲线（图1）.

图1 地衣芽孢杆菌生长曲线Fig.1 The growth curve of Bacillus licheniformis

1.2.2 紫外分光光度计法制作茶氨酸标准曲线配制100 μg∙mL-1的茶氨酸标准液.从100 μg∙mL-1的标准溶液中分别取出1.00、1.25、1.50、1.75、2.00、2.25、2.50 mL，将上述取出的溶液再各加4 mL无菌水、0.5 mL的2%茚三酮溶液、0.5 mL的pH 8.0磷酸缓冲溶液，100℃水浴反应15 min冷却至室温，超纯水定容至10 mL，此时溶液浓度为10.0、12.5、15.0、17.5、20.0、22.5、25.0 μg∙mL-1.在570 nm处测各浓度的吸光度，建立标准曲线（图2）.线性回归方程为y=58.716x-0.546，R2=0.999 3，趋势线可靠性高，可以作为茶氨酸测定标准.

图2 茶氨酸标准曲线Fig.2 The standard curve of theanine

1.2.3筛选发酵液中产γ-GT最佳条件以温度、pH值、接种量、装液量为因素，按照表1设计正交试验筛选发酵液中产γ-GT最佳条件，发酵时间均为24 h.取1 mL发酵液，5 000 r∙min-1离心15 min，弃上清液，加3 mL无菌水悬浮菌体，混匀稀释10倍.取1 mL稀释液，分别加入0.4 mL γ-谷氨酰基对硝基苯胺、0.4 mL双甘肽、1.2 mL Tris-HCL.37℃水浴30 min，405 nm处测对硝基苯胺吸光度.根据γ-GT（U∙mL-1）=D×103×（A1-A2）×Vt/（e×VS×d）计算γ-GT酶活力大小［8-9］，式中，D为稀释倍数，A1为样品吸光度值，A2为空白对照吸光度值，Vt为反应总体积，e为摩尔吸光度值（6.22×10-3mol∙L-1∙cm-2），VS为酶液体积，d为比色皿光位（1 cm）.

表1 正交试验因素水平编码Tab.1 Orthogonal experimental factor level coding

1.2.4 筛选转化液中产茶氨酸最佳条件以pH值、谷氨酰胺、乙胺盐酸盐、发酵液量为因素，按照表2设计正交试验筛选转化液中产茶氨酸的最佳条件［10］.取1 mL转化培养液，5 000 r∙min-1离心10 min.取上清液，同时加入4 mL水、0.5 mL 2%茚三酮溶液、0.5 mL pH 8.0磷酸缓冲溶液.100℃水浴反应15 min后冷却至室温，分别定容至10 mL.在570 nm处测茶氨酸吸光度.根据茶氨酸标准曲线计算出茶氨酸的产量.

表2 正交试验因素水平编码Tab.2 Orthogonal experimental factor level coding

2 结果与分析

2.1 发酵液中γ-GT酶活力根据极差Rj=maxKˉij-minKˉij的大小，可以对影响因素排列.Rj越大表明该因素的水平变化对结果影响越大.影响γ-GT酶活力因素排序为：温度＞接种量＞pH＞装液量，分别为温度28℃、接种量10%、pH 7.0、装液量30 mL，此时γ-GT酶活力为4.18 U∙mL-1（表3）.

表3 正交试验设计与结果Tab.3 Design and results of orthogonal experiments

续表3

2.2 转化液中茶氨酸含量根据表4中Rj的大小，可以得到影响因素排序为：乙胺盐酸盐＞发酵液量＞L-谷氨酰胺＞pH，最佳组合为乙胺盐酸盐2.0 mol∙L-1、发酵液量10 mL、L-谷氨酰胺0.45 mol∙L-1、pH 9.0，根据表4和图2中测定的吸光度值计算茶氨酸量，转化液中茶氨酸的量最大值为0.82 mg∙mL-1.图2茶氨酸计算公式：y=58.716x-0.546.

表4 正交试验设计与结果Tab.4 Design and results of orthogonal experiments

3 结论

采用正交试验法筛选合适的产酶和生产茶氨酸的条件，方法简单明了且结果可靠.研究得到地衣芽孢杆菌产γ-GT酶活力最高时的体系为温度28℃、接种量10%、pH 7.0、装液量30 mL，此时γ-GT酶活力为4.18 U∙mL-1；茶氨酸最佳转化体系为乙胺盐酸盐2.0 mol∙L-1、发酵液量10 mL、L-谷氨酰胺0.45 mol∙L-1、pH 9.0，此时测得茶氨酸含量为0.82 mg∙mL-1.