高效稠油降解降黏菌群的构建及其性能评价

尹凌皓，辛 瑞，郝博宇，覃菲菲，傅晓升，李茹月，孙 娟,2，张秀霞,2，李 婧

(1.中国石油大学(华东) 环境与安全工程系，山东 青岛 266580；2.石油石化污染物控制与处理国家重点实验室，北京 102206)

目前世界发现的原油资源量为1.4×1012～2.0×1012t，其中，超过2/3为稠油和沥青，中国稠油资源量超过200×108t，分布于12个沉积盆地的70多个油田，目前投入商业开发的动用地质储量约为14×108t[1]。稠油的开采、炼制造成的土壤环境问题日益突出，单井的落地原油量甚至可达其产量的2%。因此，如何去除土壤环境中的稠油污染物成为亟需解决的问题。生物修复，即利用生物特别是微生物来降解环境中石油类污染物的受控或自发过程[2]，具有修复彻底、无二次污染等优点。但是，由于稠油的黏度比较大，以胶质、沥青质为代表的重组分含量高，组分分子碳链长，生物利用度低，导致微生物对稠油的降解效果较差[3]。

胶质和沥青质是稠油中极性强、相对分子质量大的组分，也是造成稠油黏度大、难降解的主要原因[4]。国内外有关降解胶质、沥青质的特异性菌种研究较少，且以稠油为唯一碳源筛选出的降解菌对稠油胶质、沥青质的降解率极低[3]。同时，对稠油降解、降黏的研究通常以单一微生物为研究内容[5]，而对多菌种构建菌群协同降解、降黏的研究很少。Lavania等[6]采用Garciaellapetrolearia(TERIG02)对沥青质进行降解，TERIG02 可通过分解沥青质，降低原油平均相对分子质量来降低其黏度。Yasaman等[7]利用原油样品中分离到的本源细菌对原油样品中的沥青质进行生物降解，沥青质生物降解率最高达41.95%，碳、氢、氮元素的含量明显降低。Gao等[8]从含油土壤中分离得到的2株铜绿假单胞菌，能有效降解原油中难降解的沥青质，使重质组分转化为轻质组分，改变了原油的理化性质，尤其降低了原油的黏着力和黏度。Pourfakhraei等[9]用Daedaleopsissp.处理稠油后发现稠油的重组分(C24+)含量减少，轻组分(C24-)含量增加；进而利用真菌对沥青质、蒽和二苯并呋喃进行降解，其降解率分别为88.7%、93.7%和91.2%。这些研究多以稠油重质组分的降解菌筛选为目标，很少单独筛选降黏菌，更没有考察二者复配的协同增效作用。另外，单一菌株往往只适于降解一种或几种稠油组分，如：多数石油烃降解菌对胶质、沥青质鲜有降解效果，且代谢产生生物表面活性剂，从而实现稠油降黏的效果较差[10-11]。因此，筛选不同功能的菌株并进行复配，构建稠油降解、降黏效果最优的菌群具有重要的意义。

笔者将实验室前期筛选的2株高效稠油降解菌、2株高效稠油降黏菌、1株胶质沥青质降解菌进行复配，以菌群对稠油的降解率及菌液表面张力为指标，构建高效稠油降解降黏菌群；探究降解温度、菌液pH值及接种量对菌群降解、降黏稠油效果的影响，确定最佳降解条件；利用元素分析、红外光谱和GC-MS对菌群降解前后稠油的H/C比、官能团及族组成变化进行分析，评价优选菌群的降解、降黏性能，以期为稠油污染土壤的生物修复提供支持。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

菌种：各菌种菌株提取自原油污染土壤，包括：2株高效稠油降解菌Y4(苍白杆菌，Ochrobactrumanthropistrain CON21)和Y5(无色杆菌，Achromobacterpulmonisstrain PI3-03)；2株高效稠油降黏菌Y6(不动杆菌，Acinetobactersp.RS206)和Y8(铜绿假单胞菌，Pseudomonasaeruginosastrain DSM 50071)；1株高效胶质、沥青质降解菌L4(不动杆菌，Acinetobactersp.strain ZX-15)。

培养基：实验使用的培养基有LB培养基和无机盐培养基，其pH值均为7.5，组成如下：

(1)LB培养基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化钠5.0 g，蒸馏水1.0 L；

(2)无机盐培养基：氯化钠5.0 g，硫酸铵1.0 g，七水硫酸镁0.25 g，硝酸钠2.0 g，磷酸二氢钾4.0 g，磷酸氢二钾7.6 g，去离子水1.0 L。

试剂：胰蛋白胨、牛肉浸膏、琼脂粉、氯化钠、氢氧化钠、七水硫酸镁、无水磷酸氢二钾、三水合磷酸二氢钠、硝酸钠、硫酸铵、石油醚(沸程 60～90 ℃)、石油醚(沸程 30～60 ℃)、无水乙醇，均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。稠油来自胜利油田稠油厂(20 ℃时，其黏度为2750.6 mPa·s，密度为0.935 g/cm3)。

仪器：紫外可见分光光度计，UV-6000PC型，上海元析仪器公司产品；元素分析仪，Vario EL Ⅲ型，德国Elementar公司产品；傅里叶变换红外光谱仪，Antaris型，美国尼高力公司产品；高温模拟蒸馏仪，456-GC型，美国天美公司产品；全自动表面张力仪，QBZY-1型，上海方瑞仪器有限公司产品。

1.2 稠油降解率的计算

将菌株于LB培养基中培养，按体积分数5%取生长对数期的菌液5 mL加入到95 mL的降解培养基中，作为实验组样品；设稠油质量与实验组完全相同、不加菌液的样品为空白对照。35 ℃于恒温摇床培养10 d(160 r/min)，采用紫外分光光度法[12]在第10 d测定培养基的含油量，并计算稠油降解率。每组实验设置2个平行样，计算结果取平均值。稠油降解率计算公式：

η=(C0-C)/C0×100%

(1)

式中：η为稠油降解率，%；C0和C为空白样品和实验样品中稠油质量浓度，mg/L。

1.3 菌液表面张力测定

降黏菌在生长过程中会分泌生物表面活性剂，可以降低菌液的表面张力，同时也可以降低稠油的黏度。研究表明，稠油降黏率和菌株产表面活性剂的能力呈正相关，菌液表面张力越小，则菌液对稠油的降黏率越高，因此可以用表面张力值的高低来间接表征菌群的降黏性能[13-20]。

采用表面张力仪铂金板法测定菌液上清液的表面张力，将铂金板缓慢浸入菌液中，在浸入状态下由感应器感测铂金板受力的平衡值，并将其转换为上清液的表面张力值。每种菌测定3次，计算平均值。

1.4 菌群复配方法

按体积比VY4∶VY5=1∶1将Y4和Y5复配作为复合高效石油烃降解菌，记为a；按体积比VY6∶VY8=1∶1将Y6和Y8复配作为复合高效稠油降黏菌，记为b；将L4作为高效胶质、沥青质降解菌，记为c；各菌种的复配比例如表1所示。其他菌种复配条件为：降解温度35 ℃，pH=7.5，稠油质量浓度2 g/L，菌群接种体积分数5%，氯化钠质量浓度4 g/L。降解10 d后，测定石油烃降解率及下层菌液的表面张力[21]。

表1 菌群的复配方法Table 1 The method of compounding consortium

1.5 菌群降解、降黏影响因素考察方法

为探究温度对菌群降解降黏性能的影响，在pH=7.5，稠油质量浓度2 g/L，接种体积分数5%，氯化钠质量浓度4 g/L不变的条件下，调整温度分别为20、25、30、35、40 ℃，培养10 d后测菌液表面张力和稠油质量浓度，计算得稠油降解率。

为探究pH值对菌群降解降黏性能的影响，在温度35 ℃，稠油质量浓度2 g/L，接种体积分数5%，氯化钠质量浓度4 g/L不变的条件下，分别调整培养基pH值为5、6、7、7.5、8、9，培养10 d后测菌液表面张力和稠油质量浓度，计算得稠油降解率。

为探究菌液接种量对菌群降解降黏性能的影响，在温度35 ℃，pH=7.5，稠油质量浓度2 g/L，氯化钠质量浓度4 g/L不变的条件下，调整菌液接种体积分数为1%、2%、3%、5%、6%、8%、10%，培养10 d后测菌液表面张力和稠油质量浓度，计算得稠油降解率。

1.6 分析方法

使用元素分析仪测定降解前后稠油中C、H、N、S等元素的质量分数，计算氢/碳原子比(H/C)，对比稠油降解前后元素组成变化情况，分析稠油中有机化合物的定量组成和结构[22-23]。

利用配有DTGS检测器的傅里叶变换红外光谱仪对降解前后的稠油组分分子官能团进行对比分析，研究菌群的降解性能。

用索氏抽提器提取稠油培养基中的油通过GC-MS测定稠油的组成，获得稠油的高分辨率质谱图。根据GC-MS结果做出丰度随时间变化图，得到降解前后稠油的族组成图[24]，并通过族组成图分析稠油中轻、重组分的降解和转化，以及降解、降黏菌群对不同组分的降解性能[13]。

2 结果与讨论

2.1 稠油降解降黏菌群的构建

稠油是由多种烃类化合物以及少量硫化物、氮化物、环烷酸类化合物等有机物组成的复杂混合物，不同种属的菌株降解稠油的组分和途径不尽相同，因而构建菌群、利用菌株间的协同作用，往往能比用单个菌株的降解效果更好[14-17]。因此，将Y4、Y5、Y6、Y8、L4进行复配，构建了稠油降解、降黏菌群，综合考察不同复配比例下菌群对稠油的降解和降黏能力，优选降解能力最高、降黏能力较好的菌群复配比例[18-19]。

不同复配比例菌群以及相同接种体积分数的Y4、Y5单菌种对稠油的石油烃降解率和菌液表面张力如图1所示。由图1可知,降解10 d后，单一菌种(Y4、Y5)对稠油的降解率均仅为23%左右。这说明复配菌群中各菌种之间存在协同作用，其对稠油的降解性能明显好于单一菌种；H复配菌群对石油烃的降解率最高，可达到45.78%。同时，H菌群的菌液表面张力为40.7 mN/m，接近表面张力最低的I菌群(38.7 mN/m)。这是因为复配菌群中降黏菌Y6、Y8在稠油降解过程中代谢产生表面活性剂可以降低稠油黏度、提高稠油的生物利用度，并提高稠油降解菌和胶质沥青质降解菌的降解速率[25-26]。综合考虑稠油降解和降黏效果，选择H复配菌群，即Va∶Vb∶Vc=2∶1∶2(VY4∶VY5∶VY6∶VY8∶VL4=2∶2∶1∶1∶4)，为稠油降解、降黏的最优菌群。

图1 不同复配比例的菌群和Y4、Y5单菌种对石油烃的降解率和菌液表面张力Fig.1 The degradation rate of petroleum hydrocarbon and the surface tension of the consortium with different compound ratios and Y4/Y5 strainsDegradation conditions:t=10 d;T=35 ℃;pH=7;φ(Inoculation bacterials)=5%

2.2 稠油降解条件的优化

由于菌群是一个内部相互影响的复杂协作体，不同菌种间在对稠油降解和降黏方面可能相互影响，因此菌群的降解条件和单一菌种可能不完全一致。为了使菌群之间更好的发挥协同效应，提高其对稠油的降解、降黏性能，进一步探究、优化了菌群对稠油的降解、降黏条件，如菌种降解稠油的温度、培养基pH值、菌液接种量等[27-28]，测定了不同条件下稠油的降解率和菌液表面张力变化。

2.2.1 温度

按照Va∶Vb∶Vc=2∶1∶2的最优复配比例，不同温度下菌群对稠油的降解率和菌液表面张力见图2。由图2可知：菌群在20～40 ℃时的稠油降解率均在30%以上；在30～35 ℃间，菌群最为活跃，降解效果较好；当降解温度为35 ℃、当pH=7.5时，稠油降解率高达44.12%，此时菌液的表面张力最低。这说明35 ℃时菌群的整体活性最高，能迅速降解稠油组分，并产生大量生物表面活性剂。

图2 不同温度下的稠油降解率和菌液表面张力Fig.2 Degradation rate of heavy oil and bacterial liquid surface tension of consortium at different temperaturesDegradation conditions:t=10 d;pH=7.5;φ(Inoculation bacterials)=5%

2.2.2 培养基pH值

不同培养基pH值下菌群对稠油的降解率和菌液表面张力的影响如图3所示。由图3可知：菌群在pH=5～9时对稠油的降解率均在20%以上；其中，当pH=7.5时，菌群对稠油的10 d降解率为为42.14%，菌液表面张力降到44.1 mN/m。另外，菌群在中性和偏碱性的环境中活性比酸性环境更高。在实际应用中，由于土壤酸碱度与地理、气候和土壤历史利用情况有关[29]，因此，对于酸性土壤，则需要预先调整其pH值才能较好地实现稠油的降解。

图3 菌群在不同pH值下的稠油降解率和菌液表面张力Fig.3 Degradation rate of heavy oil and bacterial liquid surface tension of consortium at different pH valuesDegradation conditions:t=10 d;T=35 ℃;φ(Inoculation bacterials)=5%

2.2.3 菌液接种量

探究菌液不同接种量下菌群对稠油的降解率和菌液表面张力变化情况，结果见图4。由图4可知：当菌液接种体积分数小于3%时，由于菌量太少，菌群无法在短时间内对大量稠油进行快速充分的降解，菌群对稠油的降解率较低且菌液表面张力较大；随着菌液接种量的增大，菌液表面张力逐渐降低，菌群对稠油的降解率呈上升趋势；但是当菌液接种体积分数大于5%时，继续增大接种量，稠油降解率的变化不明显，且菌液表面张力下降幅度减小。这是因为菌液接种量过大时，菌种间的竞争作用增强，营养物质、氧气和生长空间受限，菌群大量繁殖导致的代谢物质积累又会抑制其自身生长，因此稠油降解率的上升停滞，并推测如果进一步增大菌液接种量，稠油降解率可能会下降[30]。所以从经济和降解效果两方面考虑，将最佳菌液接种体积分数定为5%，此时菌群对稠油的降解率达到最大。

图4 菌群在不同接种量下对稠油的降解率和菌液表面张力Fig.4 The degradation rate of heavy oil and the surface tension of the consortium under different inoculation amountDegradation conditions:t=10 d;T=35 ℃;pH=7.5

2.3 高效稠油降解、降黏菌群的性能分析

2.3.1 稠油氢/碳原子比的变化

稠油的氢/碳原子比(n(H)/n(C))是反映稠油化学组成的一个重要参数。H/C原子比是与烃类化合物化学结构及其相对分子质量有关的参数，随着其组分分子中环状结构的增多，稠油H/C原子比下降，尤其是随着稠油组分中芳香环的增多，其H/C原子比显著减小[31]。此外，H/C原子比可以反映原油的属性，一般轻质原油或石蜡基原油的n(H)/n(C)高(约1.9)，重质原油或环烷基原油n(H)/n(C)低(约1.5)。菌群降解前后的稠油C、H、N、S元素组成见表2。

由表2可知，复配菌群作用后，稠油中C质量分数减小，H质量分数增大，其H/C原子比增大。说明通过菌群的降解作用，稠油的饱和度提高。而菌群中的降黏菌产生表面活性剂，表面活性剂与稠油混合后,首先发生破乳作用,脱出稠油中含的部分水,然后脱出水与表面活性剂共同与稠油形成低黏度的水包油型乳状液,从而实现稠油降黏。这一过程可以分为2个阶段：第1阶段是破乳降黏，第2阶段是乳化降黏[32]，2个阶段共同作用使稠油黏度降低，更利于分散，从而易于被降解菌捕获降解，提高了稠油降解菌对稠油的降解率。

表2 菌群作用前后稠油的元素组成Table 2 Element composition of heavy oil before and after consortium degradation

2.3.2 稠油的官能团变化

为了对菌群作用前后稠油组分中官能团种类和数量的变化情况进行分析，对稠油进行了红外光谱表征，见图5。由图5可以看出，降解前后的稠油在2920 cm-1和2851 cm-1处有最强的—CH2—吸收峰，同时在1460 cm-1和1376 cm-1附近均显示出明显的脂肪烃甲基和亚甲基的面内伸缩振动吸收峰。与降解前相比，降解后的稠油在2800～3000 cm-1处的吸收峰增强，该峰是由于饱和烃中C—H伸缩振动产生的，表明菌群降解后的稠油饱和度提高。而菌群作用后1606、1508、1459 cm-1处苯环的C=C伸缩振动吸收峰略微增强，推测是一部分稠环化合物转化为单环化合物。研究表明[33]，细菌降解多环芳烃的过程十分缓慢且复杂，会产生部分单环芳香中间产物，如芳香族的酯类、醚类、醇类物质以及苯环的临、间、对取代物，如图5中806、1031、1094、1256 cm-1处的吸收峰增强也可以印证这一点。综上，经过复配菌群的降解，稠油的组分变得更加轻量化，同时更趋向于饱和，说明复配菌群具有良好的稠油降解性能。

图5 菌群作用前后稠油的红外谱图Fig.5 Infrared spectra of heavy oil before and after being degraded by consortium

2.3.3 稠油族组成的变化

采用GC-MS分析稠油在菌群作用前后的族组成，见图6。在GC-MS图谱中，由于稠油中不同组分的含量不同其绝对丰度值也不同，因此可以采用某一组分绝对丰度与其余组分绝对丰度之和的比值，即该组分的相对丰度，来观察降解前后稠油中不同碳数的组分变化，并据此定性分析菌种的降解性能。

由图6可以看出：降解前，稠油的主要成分为C6～C30的化合物，C10+化合物占比约88.7%，其中C20占比最高，为19.65%，其次是C19，占比为16.86%，同时也有少量C30～C44化合物分布；降解后，各组分的相对丰度均明显降低，说明菌群对各个组分均有不同程度的降解；除C28、C30、C36、C44少量残留外，C23以上的其他重组分完全被降解；与降解前相比，降解后的稠油中C12-组分的相对丰度降低了33.82%～100%，说明菌群对短链化合物也有较好的降解效果。综上，说明复配后的菌群对稠油各组分都具有较宽的利用性。此外，菌群作用后C13、C14、C18、C22、C36的含量有所增加，推测其可能是长链烃化合物，因为降解过程中菌群难以将长链烃直接分解为CO2和H2O，而是先将其分解为短链烃，再慢慢进行分解，因而一些中间产物的含量略有增加[34]。这与Pourfakhraei等[9]的发现一致。

图6 菌群作用前后稠油的族组成Fig.6 Group composition of heavy oil before and after consortium degradation

3 结 论

(1)采用复配2株高效稠油降解菌、2株高效稠油降黏菌、1株胶质沥青质降解菌，得到一个高效稠油降解降黏菌群，各菌种的最优复配体积比为VY4∶VY5∶VY6∶VY8∶VL4=2∶2∶1∶1∶4。菌群对稠油的最佳降解条件为：温度35 ℃，pH值7.5，接种体积分数5%，此条件下菌群对稠油的10 d降解率为42%～44%，优于单一菌种的 10 d降解率(约23%)。

(2)菌种对稠油降解后，稠油的H/C原子比升高，饱和度提高，重组分变轻。其中，重质组分相应转化为饱和分及芳香分；中、长链烷烃含量大幅度下降；这说明该菌群对稠油各组分的可利用性都具有优秀的降解性能，证明了降解、降黏菌对石油烃的降解有协同增效的作用。